Summary
Метод скрининга для выявления окислительных средах сотовой является измерение окисления CM-H2DCFDA. Как только окисленный в клетке, CM-H2DCFDA изменениями от не-флуоресцентный в флуоресцентным соединением. Это изменение в флуоресценции измеряют с помощью проточной цитометрии и указывает на количество клеток в окислительной среде.
Abstract
Часто предложил механизм индуцированного вирусом повреждению нейронов является окислительный стресс. Астроциты играют важную роль в борьбе с окислительным стрессом из центральной нервной системы (ЦНС). Астроциты поддержания гомеостатического среду для нейронов, а также защиты нейронов от активных форм кислорода (АФК). CM-H2DCFDA является клетка-проницаемой индикатор присутствия АФК. CM-H 2 DCFDA проникает в клетку, как не-флуоресцентным соединением, и становится флуоресцентные после клеточного эстераз удалить ацетатных групп, а также соединение окисляется. Число клеток, измеренная с помощью проточной цитометрии, которые будут признаны зеленый флуоресцирующий является показателем количества клеток, которые находятся в окислительного состояния. CM-H 2 DCFDA подвержен окислению большое количество различных АФК. Это отсутствие специфичности, в отношении которых АФК могут окислять CM-H 2 DCFDA, делает это соединение ценные регентом для использования в ранних стадиях патогенеза расследования, так как этот анализ может быть использован для выявления окислительного клеточного окружения независимо от кислорода радикальные или комбинацию АФК отвечают за клеточный условиях. Как только это было установлено, что АФК присутствуют при окислении CM-H 2 DCFDA, то дополнительные эксперименты могут быть выполнены, чтобы определить, какие ROS или комбинации РОСС участвуют в конкретном процессе патогенеза. Результаты этого исследования показывают, что с добавлением перекиси водорода увеличение CM-H 2 DCFDA флуоресцируют было обнаружено по отношению к солевым управления, указывающий, что этот анализ является ценным тест для определения окислительной среды, в G355-5 клеток, кошачьих астроцитов клеточной линии.
Protocol
1. Клеточные культуры кошачьих астроциты и лечение с Н 2 О 2
- Культуры клеточной линии G355-5 в 75 см 2 колбы со средствами массовой информации DMEM плюс питательные вещества при 37 ° С и 5% CO 2 до 60% сливной (~ 5 дней). Замените СМИ каждые 1-2 дня или по мере необходимости для поддержания здоровой культуры.
- Удалить медиа и добавьте 2 мл 0,25% трипсина. Поднимите клетки с помощью пипетки на 45 с - 1 мин при комнатной температуре (RT).
- Быстрый перенос суспензии 15 мл коническую пробирку, содержащую 10 мл среды. Осторожно перемешать.
- Центрифуга при 300 мкг, 23 ° C в течение 3 мин для получения гранул. Удалите супернатант, не нарушая гранул.
- Добавить 6-7 мл свежей среды и ресуспендирования клеток.
- Добавить ~ 1 мл клеток в каждую лунку 6-луночный планшет. Добавьте 2-3 мл среды в каждую лунку и инкубировать до 80-90% вырожденная.
- Подготовка 100 мкм раствор перекиси (H 2 O 2) в средствах массовой информации.
- Удаление информации из каждой лунки и заменить либо 2 мл свежей среды (контроль), 2 мл H 2 O 2 (лечения) или 2 мл DPBS. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 3 ч.
- Удалить решений и добавьте 1 мл трипсина поднять клеток. Передача клетки 1,7 мл Eppendorf трубка, содержащая 0,5 DPBS мл. Этот шаг должен выполняться на каждой скважине индивидуально, чтобы предотвратить гибель клеток от длительной инкубации трипсином.
- Спиновые при 300 мкг в течение 3 мин, отбросить супернатант и ресуспендируют в 1 мл DPBS.
2. Окрашивание для ROS
- Все шаги для окрашивания должна осуществляться с минимальным воздействием света, чтобы предотвратить обесцвечивание.
- Добавить 1 мкл 50 мМ CCCP для положительного контроля. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 5 мин.
- Добавьте 5 мкл 10 мМ CM-H 2 DCFDA решение H 2 O 2 группы. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 15-30 мин. Нет пятно добавляется солевой образца.
- Вымойте образцов с 2 мл DPBS для удаления остатков пятна.
- Спиновые при 300 мкг в течение 3 мин для получения гранул.
- Ресуспендируют клеток в 0,5 мл DPBS. Добавить 1 мкл PI для каждого образца, за исключением физиологического раствора.
- Передача образцов 5 мл трубки цитометр потока.
- Запустить на поток цитометр.
3. Проточная цитометрия
- Выполнить образцов на Beckman Coulter FC500 (или эквивалент), оснащенный 488 нм аргонового лазера и проходит следующие группы: 525, 775 и 620 нм, все ± 20 нм.
- Подготовка соответствующего контроля: неокрашенные клетки, CM-H 2 DCFDA окрашенных только, П. только дважды окрашенные (отрицательный контроль).
- Сделать это протокол, который имеет следующие histoplots: FS против SS, П. И. против CM-H 2 DCFDA. Он также должен иметь следующие гистограммы: количество клеток по сравнению с FL1, FL2 и FL3, что соответствует пятен.
- Перед запуском образцов, проверка оборудования, жидкости и контейнер для отходов. Разминка оборудования не менее 20 мин.
- Очистите оборудование и выполнять калибровку с соответствующим бисером по производителям стандартам.
- Выберите протокол и выполнения образцов.
- Чистая оборудования как это было сделано ранее.
- Чистая вакуумной линии в соответствии с производителями стандартам.
- Выключите поток и чистая голова / вакуумной линии.
- Выключите программное обеспечение и компьютер.
4. Представитель Результаты:
Результаты проточной цитометрии были проанализированы с использованием FlowJo 7,6 и пятна контроля были использованы для объективного набора стробирования. Основываясь на этом, здоровые клетки появляются в левой части гистограммы и АФК (оксидативный стресс) была определена как сдвиг клетки с правой стороны. На рисунке 1 показаны результаты влияния перекиси водорода на здоровых кошачьих астроцитов. Данные FL1 был использован для измерения интенсивности CM-H 2 DCFDA, что указывает на наличие АФК. Как и ожидалось, большее количество АФК был обнаружен в образце получавших Н 2 О 2. Эта информация отображается на гистограмме, как изменение интенсивности флуоресцентного слева направо. При сравнении здоровых клетках, обработанных DMEM против DPBS, не было никаких существенных изменений в количестве ROS (рис. 2).
Рисунок 1. Проточная цитометрия результаты уровня окислительного стресса у здоровых кошачьих астроциты и эффект Н 2 О 2 на здоровые клетки. Результаты показывают, что Н 2 О 2 повышает уровень АФК в здоровых клетках по сравнению с клетками с отсутствием лечения (DMEM).
Рисунок 2. Проточной цитометрии результаты уровни образования АФК обнаружен в здоровые клетки инкубировали в течение 3 часов с DPBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Часто предлагается механизм индуцированного вирусом повреждению нейронов является окислительный стресс 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. В основном, предлагается, чтобы через вирусные воздействия глии (астроцитов и микроглии) выпуск реактивных кислородных радикалов, таких как, гидроксид, супероксид-анион, оксид азота, и / или перекись водорода, которые являются токсичными для нейронов. Кроме того, окислительный стресс также были предложены в качестве основной патологический механизм в метамфетамина вызванной нейротоксичности 2, 6, 17. Так как наша группа заинтересована в действия обоих вирусов и наркотики на центральную нервную систему, мы решили использовать быстрый скрининг-тест, чтобы определить настоящий избыточного АФК астроцитов. Большинство нейронов глутатион производится астроциты, а затем доставлен в нейронах 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Таким образом, астроциты роль в окислительный стресс играет важную роль в поддержании гомеостатических среду для нейронов, а также защитить нейроны от АФК, и является причиной того, что астроциты культуры клеток были выбраны для данного исследования.
CM-H 2 DCFDA также известен как 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеина и H2DCF. CM-H 2 DCFDA является клетка-проницаемой индикатором наличия активных форм кислорода. CM-H 2 DCFDA проникает в клетку, как не-флуоресцентным соединением, которое становится флуоресцентные после клеточного эстераз удалить ацетатных групп, а также соединение окисляется. Оказавшись внутри клетки и ацетатных групп удаляются, CM-H 2 DCFDA может окисляться число видов АФК, в том числе оксида азота, пероксинитрита анионы, перекись водорода и органических гидроперекисей 3, 14, 25, в результате чего зеленый флуоресцентного продукта 23, 28. Это отсутствие указать в АФК, которые могут окисляться CM-H 2 DCFDA, делает его ценным реагентом в ранних стадиях патогенеза расследования, в котором окислительный стресс механизм, как полагают, играет роль, но неизвестно, какое радикалов кислорода могут быть задействованы, а не испытание для каждого АФК отдельно. Как только это было установлено, что АФК присутствуют при окислении CM-H 2 DCFDA, то дополнительные эксперименты могут быть выполнены, чтобы определить, какие ROS или комбинации РОСС участвуют в конкретном процессе патогенеза. Результаты этого настоящего исследования показывают, что с добавлением перекиси водорода увеличение CM-H 2 DCFDA флуоресцируют была обнаружена при сравнении с солевым контролем, что свидетельствует о том, что этот анализ является ценным тест для определения окислительной среды, в G355-5 клеток, кошачьих астроцитов клеточной линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы благодарим ReadiSorb продукты за их щедрую поддержку этих исследований.
Acknowledgments
Мы благодарим ReadiSorb продукты за их щедрую поддержку этих исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M.
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
