Summary
Ein Screening-Verfahren zur oxidativen zellulären Umgebungen erkennen ist, um die Oxidation von CM-H2DCFDA messen. Sobald in einer Zelle, CM-H2DCFDA Änderungen von nicht-fluoreszierenden in einen fluoreszierenden Verbindung oxidiert. Diese Änderung in der Fluoreszenz wird mittels Durchflusszytometrie gemessen und gibt die Anzahl der Zellen in einer oxidativen Umgebung.
Abstract
Eine häufig vorgeschlagene Mechanismus der Virus-induzierten neuronalen Schädigung ist oxidativer Stress. Astrozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von oxidativem Stress des Zentralen Nervensystems (ZNS). Astrozyten zur Aufrechterhaltung eines homöostatischen Umgebung für Neuronen sowie Schutz der Neuronen von Reactive Oxygen Species (ROS). CM-H2DCFDA ist ein zellpermeablen Indikator für die Anwesenheit von ROS. CM-H 2 DCFDA in die Zelle als nicht-fluoreszierende Verbindung, und wird fluoreszierende nach zelluläre Esterasen entfernen Sie die Acetat-Gruppen, und die Verbindung wird oxidiert. Die Anzahl der Zellen, mittels Durchflusszytometrie gemessen, dass gefunden zu grün fluoreszierenden sind ein Indiz für die Anzahl der Zellen, die in einer oxidativen Zustand sind. CM-H 2 DCFDA ist anfällig für eine Oxidation durch eine große Anzahl verschiedener ROS. Dieser Mangel an Spezifität in Bezug auf die ROS können CM-H 2 DCFDA oxidieren, macht diese Verbindung eine wertvolle Regenten für den Einsatz in den frühen Phasen eines Pathogenese Untersuchung, da dieser Test kann auf dem Bildschirm für eine oxidative zellulären Umgebung, unabhängig von der Sauerstoff verwendet werden Radikal oder Kombination von ROS sind verantwortlich für die zelluläre Bedingungen. Nachdem festgestellt wurde, dass ROS Gegenwart durch Oxidation von CM-H 2 DCFDA, dann weitere Experimente durchgeführt werden, um festzustellen, welche ROS oder eine Kombination von Ross in der jeweiligen Pathogenese beteiligt sind, sind. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mit der Zugabe von Wasserstoffperoxid eine Erhöhung der CM-H 2 DCFDA fluoreszieren wurde gegenüber dem Kochsalzkontrollen, entdeckt darauf hinweist, dass dieser Test ein wertvolles Test zum Nachweis einer oxidativen Umgebung innerhalb G355-5-Zellen, einer ist feline Astrozyten-Zelllinie.
Protocol
1. Zellkultur von feline Astrozyten und die Behandlung mit H 2 O 2
- Kultur-Zelllinie G355-5 in eine 75 cm 2-Kolben mit DMEM-Medium plus Nährstoffe bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zu 60% konfluent (~ 5 Tage). Ersetzen Sie die Medien alle 1-2 Tage oder bei Bedarf auf eine gesunde Kultur aufrecht zu erhalten.
- Entfernen Sie das Medium und 2 ml 0,25% Trypsin. Heben Sie die Zellen durch Pipettieren für 45 s - 1 min bei Raumtemperatur (RT).
- Schnelle Übertragung der Suspension auf eine 15 ml konische Röhrchen mit 10 ml Medium. Vorsichtig mischen.
- Bei 300 g zentrifugiert, 23 ° C für 3 min zu einem Pellet zu erhalten. Überstand verwerfen, ohne das Pellet.
- Fügen Sie 6-7 ml frisches Medium und Zellen.
- Add ~ 1 ml der Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Fügen Sie 2-3 ml Medium in jede Vertiefung und inkubieren, bis 80-90% konfluent.
- Bereiten Sie eine 100 &mgr; Lösung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) in den Medien.
- Entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen entweder mit 2 ml frisches Medium (Kontrolle), 2 ml H 2 O 2 (Behandlung) oder 2ml DPBS. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 h.
- Remove-Lösungen und 1 ml Trypsin auf die Zellen zu heben. Transfer-Zellen zu einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen mit 0,5 ml DPBS. Dieser Schritt sollte auf jedes Well einzeln durchgeführt werden, um den Zelltod bei längerer Trypsin Inkubation zu verhindern.
- Spin bei 300 xg für 3 min, den Überstand verwerfen und Zellen in 1 ml DPBS.
2. Färbung für ROS
- Alle Schritte zur Färbung sollte mit minimalen Belichtung zu verhindern Bleichen durchgeführt werden.
- Add 1 ul 50 mM CCCP mit der positiven Kontrolle. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min.
- Add 5 ul einer 10 mM CM-H 2 DCFDA Lösung des H 2 O 2-Gruppe. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 15-30 min. Kein Fleck ist an der Saline Probe zugegeben.
- Wash Proben mit 2 ml DPBS um restliche Fleck zu entfernen.
- Spin bei 300 xg für 3 min zu einem Pellet zu erhalten.
- Die Zellen in 0,5 ml DPBS. Fügen Sie 1 ul PI zu jeder Probe, mit Ausnahme der Kochsalzlösung.
- Transfer-Proben auf eine 5ml Durchflusszytometer Röhre.
- Run am Durchflusszytometer.
3. Durchflusszytometrie
- Run Proben auf einem Beckman Coulter FC500 (oder gleichwertig) mit einem 488 nm Argon-Laser und die folgenden Bandpässe ausgestattet: 525, 775 und 620 nm, alle ± 20 nm auf.
- Bereiten Sie die entsprechenden Steuerelemente: ungefärbte Zellen, angefärbt CM-H 2 DCFDA nur, PI nur, doppelt gefärbt (Negativ-Kontrolle).
- Machen Sie ein Protokoll, das die folgenden histoplots hat: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Es sollte auch die folgenden Histogramme: Zellzahl vs FL1, FL2 und FL3, die die Flecken entspricht.
- Bevor Sie die Proben, überprüfen Ausrüstung, Flüssigkeiten und Abfallbehälter. Warm up die Ausrüstung für mindestens 20 min.
- Reinigen Sie die Ausrüstung und eine Kalibrierung mit den entsprechenden Perlen nach Herstellerangaben Standards.
- Wählen Sie Ihr Protokoll und laufen die Proben.
- Reinigen Sie das Gerät als gemacht vorher.
- Reinigen Sie die Saugleitung nach dem Hersteller-Standards.
- Schalten Sie den Strom und reinigen Sie den Kopf / Vakuum-Leitung.
- Schalten Sie die Software und den Computer neu.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Durchflusszytometrie Ergebnisse wurden mit FlowJo 7,6 und der Fleck Kontrollen wurden verwendet, um objektiv stellen Sie die Gating. Auf dieser Basis erscheinen gesunde Zellen auf der linken Seite des Histogramms und ROS (oxidativer Stress) wurde als eine Verlagerung von Zellen auf der rechten Seite festgestellt. Abbildung 1 zeigt die Ergebnisse der Wirkung von Wasserstoffperoxid auf gesunde Katzen Astrozyten. Daten von FL1 wurde verwendet, um die Intensität der CM-H 2 DCFDA, die die Anwesenheit von ROS zeigt messen. Wie erwartet, wurde eine größere Menge an ROS in der Probe mit H 2 O 2 behandelt wurden. Dies ist auf das Histogramm als eine Verschiebung in der Fluoreszenzintensität von links nach rechts angezeigt. Beim Vergleich von gesunden Zellen mit DMEM gegenüber DPBS behandelt, es gab keine signifikante Änderung in der Höhe von ROS (Abb. 2).
Abbildung 1. Durchflusszytometrie Ergebnisse der Ebenen von oxidativem Stress bei gesunden Katzen Astrozyten und die Wirkung von H 2 O 2 auf gesunde Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass H 2 O 2 Ebenen der ROS in gesunden Zellen erhöht sich um Zellen, die mit keiner Behandlung (DMEM) verglichen.
Abbildung 2. Durchflusszytometrie Ergebnisse Niveau von ROS in gesunden Zellen für 3h mit DPBS inkubiert erkannt.
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Discussion
Ein häufig vorgeschlagene Mechanismus der Virus-induzierten neuronalen Schädigung ist oxidativer Stress 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Grundsätzlich wird vorgeschlagen, dass durch virale Belastung der Glia (Astrozyten und Mikroglia) Freisetzung reaktiver Sauerstoff-Radikale, wie Hydroxid, Superoxidanion, Stickstoffmonoxid und / oder Wasserstoffperoxid, die giftig für Nervenzellen sind. Ebenso hat oxidativer Stress auch als ein wichtiger Pathomechanismus in Methamphetamin-induzierte Neurotoxizität 2, 6, 17 vorgeschlagen worden. Da unsere Gruppe in die Effekte beider Viren und Drogen auf das ZNS interessiert ist, wählten wir eine schnelle Screening-Test verwenden, um die Gegenwart von überschüssigem ROS in Astrozyten zu bestimmen. Die Mehrheit der neuronalen Glutathion wird durch die Astrozyten produziert und dann an die Neuronen 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30 geliefert. So ist die Astrozyten Rolle von oxidativem Stress bei der Aufrechterhaltung eines homöostatischen Umgebung für Neuronen sowie Schutz der Neuronen von ROS wichtig, und ist der Grund, dass Astrozyten-Zellkulturen für diese Studie ausgewählt wurden.
CM-H 2 DCFDA ist auch als 2 ', 7'-Dichlorfluorescein und H2DCF bekannt. CM-H 2 DCFDA ist ein zellpermeablen Indikator für Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies. CM-H 2 DCFDA in die Zelle als nicht-fluoreszierende Verbindung, die fluoreszierende wird nach zelluläre Esterasen entfernen Sie die Acetat-Gruppen, und die Verbindung wird oxidiert. Einmal in der Zelle und die Acetat-Gruppen entfernt werden, kann die CM-H 2 DCFDA durch eine Reihe von ROS oxidiert werden, einschließlich Stickoxid, Peroxynitrit-Anionen, Wasserstoffperoxid und organische Hydroperoxide 3, 14, 25, die sich in einem grünen fluoreszierende Produkt 23, 28. Dieser Mangel an in der ROS angeben, welche CM-H 2 DCFDA oxidieren, macht ihn zu einem wertvollen Reagenzien in den frühen Phasen eines Pathogenese Untersuchung, bei der ein oxidativer Stress-Mechanismus angenommen, dass eine Rolle spielen wird, aber es ist unbekannt, welche Sauerstoff-Radikal beteiligt sein könnte, anstatt Test für jede ROS getrennt. Nachdem festgestellt wurde, dass ROS Gegenwart durch Oxidation von CM-H 2 DCFDA, dann weitere Experimente durchgeführt werden, um zu bestimmen, die ROS oder eine Kombination von Ross in der jeweiligen Pathogenese beteiligt sind. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass mit der Zugabe von Wasserstoffperoxid eine Erhöhung der CM-H 2 DCFDA fluoreszieren wurde erkannt, wenn die Salzlösung Kontrolle verglichen, was darauf hinweist, dass dieser Test ist wertvoll Test zum Nachweis einer oxidativen Umgebung innerhalb der G355-5 Zellen, eine Katze Astrozyten-Zelllinie.
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Disclosures
Wir danken ReadiSorb Produkte für ihre großzügige Unterstützung dieser Studien.
Acknowledgments
Wir danken ReadiSorb Produkte für ihre großzügige Unterstützung dieser Studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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