Summary
Een screening methode om oxidatieve cellulaire omgevingen te detecteren is het meten van de oxidatie van CM-H2DCFDA. Zodra geoxideerd in een cel, CM-H2DCFDA veranderingen ten opzichte van niet-fluorescerende in een fluorescerende verbinding. Deze verandering in fluorescentie wordt gemeten door middel van flowcytometrie en geeft het aantal cellen in een oxidatieve omgeving.
Abstract
Een vaak geopperd mechanisme van virus geïnduceerde neuronale schade is oxidatieve stress. Astrocyten hebben een belangrijke rol in het controleren van oxidatieve stress van het centrale zenuwstelsel (CZS). Astrocyten helpen handhaven van een homeostatische omgeving voor neuronen als het beschermen van neuronen van reactive oxygen species (ROS). CM-H2DCFDA is een cel-permeabele indicator voor de aanwezigheid van ROS. CM-H 2 DCFDA komt in de cel als een niet-fluorescerende verbinding, en wordt fluorescerende na cellulaire esterases verwijder de acetaat groepen, en de verbinding is geoxideerd. Het aantal cellen, gemeten door middel van flowcytometrie, die worden gevonden om groene fluorescerende worden is een indicatie van het aantal cellen die in een oxidatieve toestand. CM-H 2 DCFDA is gevoelig voor oxidatie door een groot aantal verschillende ROS. Dit gebrek aan specificiteit, over welke ROS kunnen CM-H 2 DCFDA oxideren, maakt deze verbinding een waardevolle regent voor gebruik in de vroege stadia van een pathogenese onderzoek, omdat deze test kan worden gebruikt om te screenen op een oxidatieve cellulaire omgeving, ongeacht welke zuurstof radicaal of combinatie van ROS zijn verantwoordelijk voor de cellulaire condities. Zodra is vastgesteld dat ROS aanwezig zijn door oxidatie van CM-H 2 DCFDA, dan is extra experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen welke ROS of combinatie van Ross zijn betrokken bij de pathogenese bijzonder proces. De resultaten van deze studie tonen aan dat met de toevoeging van waterstofperoxide een toename van de CM-H 2 DCFDA fluoresceren was ten opzichte van de zoutoplossing controles aangetroffen, wat aangeeft dat deze test is een waardevolle test voor het detecteren van een oxidatieve omgeving binnen G355-5-cellen, een katachtige astrocyten cellijn.
Protocol
1. Cel cultuur van katachtige astrocyten en de behandeling met H 2 O 2
- Cultuur cellijn G355-5 in een 75 cm 2 kolf met DMEM media plus voedingsstoffen bij 37 ° C en 5% CO 2 tot 60% confluent (~ 5 dagen). Vervang de media om de 1-2 dagen of als nodig is om een gezonde cultuur te behouden.
- Verwijder de media en voeg 2 ml van 0,25% trypsine. Til de cellen door pipetteren voor 45 s - 1 min bij kamertemperatuur (RT).
- Snel overbrengen van de schorsing aan een 15 ml conische buis met 10 ml van de media. Meng voorzichtig.
- Centrifugeer op 300 xg, 23 ° C gedurende 3 minuten tot een pellet te verkrijgen. Giet het supernatans af zonder de pellet te verstoren.
- Voeg 6-7 ml vers medium en resuspendeer de cellen.
- Voeg ~ 1 ml van de cellen aan elke well van een 6-wells plaat. Voeg 2-3 ml van de media aan elk putje en incubeer tot 80-90% confluent.
- Bereid een oplossing van 100 urn peroxide (H 2 O 2) in de media.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit elk putje en te vervangen door een 2 ml vers medium (controle), 2 ml H 2 O 2 (behandeling) of 2 ml DPBS. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 3 uur
- Verwijder de oplossingen en voeg 1 ml trypsine om de cellen te tillen. Overdracht cellen om een 1,7 ml Eppendorf buis met 0,5 ml DPBS. Deze stap moet worden uitgevoerd op elke zowel individueel om celdood te voorkomen dat langdurig trypsine incubatie.
- Draaien op 300 xg gedurende 3 min, schenk de bovenstaande en resuspendeer in 1 ml DPBS.
2. Kleuring voor ROS
- Alle stappen voor kleuring dient te worden uitgevoerd met een minimale blootstelling aan licht om te voorkomen dat bleken.
- Voeg 1 ui 50 mM CCCP aan de positieve controle. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 gedurende 5 minuten.
- Voeg 5 pi van een 10 mM CM-H 2 DCFDA oplossing voor de H 2 O 2-groep. Incubeer bij 37 ° C, 5% CO 2 voor 15-30 minuten. Geen enkele vlek wordt toegevoegd aan het zout monster.
- Was monsters met 2 ml van DPBS om de resterende vlek te verwijderen.
- Draaien op 300 xg gedurende 3 minuten tot een pellet te verkrijgen.
- Resuspendeer cellen in 0,5 ml DPBS. Voeg 1 ui PI tot elk monster, behalve de zoutoplossing.
- Overdracht monsters om een 5 ml flowcytometer buis.
- Run op de flowcytometer.
3. Flowcytometrie
- Lopen monsters op een Beckman Coulter FC500 (of gelijkwaardig) uitgerust met een 488 nm argon laser en de volgende band gaat: 525, 775 en 620 nm, alle ± 20 nm.
- Bereid de juiste besturingselementen: ongekleurde cellen, CM-H 2 DCFDA bevlekt alleen PI alleen, dubbel glas (negatieve controle).
- Maak een protocol dat de volgende histoplots heeft: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Het moet ook de volgende histogrammen: aantal cellen vs FL1, FL2 en FL3, wat overeenkomt met de vlekken.
- Voor het uitvoeren van de monsters, controleert apparatuur, vloeistoffen en afval container. Warm de camera gedurende ten minste 20 minuten.
- Het reinigen van de apparatuur en het uitvoeren van een kalibratie met de juiste kralen volgens de fabrikant normen.
- Selecteer uw protocol en laat de monsters.
- Het reinigen van de apparatuur, zoals eerder gedaan.
- Reinig de vacuum lijn volgens de fabrikant normen.
- Schakel de stroom en het reinigen van de kop / vacuüm lijn.
- Schakel de software en de computer.
4. Representatieve resultaten:
Flowcytometrie resultaten werden geanalyseerd met behulp van FlowJo 7,6 en de vlek controles werden gebruikt om objectief te stellen van de gating. Op basis van deze, gezonde cellen verschijnen aan de linkerkant van het histogram en ROS (oxidatieve stress) werd gedetecteerd als een verschuiving van cellen aan de rechterkant. Figuur 1 toont de resultaten van het effect van waterstofperoxide op gezonde katten astrocyten. Gegevens van FL1 werd gebruikt om de intensiteit van de CM-H 2 DCFDA, die de aanwezigheid van ROS geeft aan te meten. Zoals verwacht, was een hoger bedrag van de ROS aangetroffen in het monster behandeld met H 2 O 2. Dit wordt weergegeven op het histogram als een verschuiving in de fluorescentie-intensiteit van links naar rechts. Bij het vergelijken van gezonde cellen behandeld met DMEM versus DPBS, was er geen significante verandering in de hoeveelheid van de ROS (figuur 2).
Figuur 1. Flowcytometrie resultaten van het niveau van oxidatieve stress bij gezonde katten astrocyten en het effect van H 2 O 2 op gezonde cellen. De resultaten geven aan dat H 2 O 2 niveaus van ROS in gezonde cellen stijgt in vergelijking met cellen met geen behandeling (DMEM).
Figuur 2. Flow cytometrie resultaten van het niveau van de ROS gedetecteerd in gezonde cellen geïncubeerd gedurende 3 uur met DPBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een vaak voorgestelde mechanisme van het virus geïnduceerde neuronale schade is oxidatieve stress 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. In principe, wordt voorgesteld dat door middel van virale blootstelling aan de glia (astrocyten en microglia) release reactieve zuurstofradicalen, zoals, hydroxide, superoxide anion, stikstofoxide, en / of waterstof peroxide, die giftig zijn voor neuronen. Ook heeft oxidatieve stress ook voorgesteld als een belangrijke pathologische mechanisme in methamphetamine-geïnduceerde neurotoxiciteit 2, 6, 17. Aangezien onze groep is geïnteresseerd in de effecten van zowel de virus en drugs op het centrale zenuwstelsel, we gekozen voor een snelle screening test te gebruiken om het heden van overtollige ROS in astrocyten bepalen. De meerderheid van de neuronale glutathion wordt geproduceerd door de astrocyten en vervolgens aan de neuronen 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Zo, de astrocyten rol in de oxidatieve stress is belangrijk in het handhaven van een homeostatische omgeving voor neuronen als het beschermen van neuronen van de ROS, en is de reden dat astrocyt celkweken werden gekozen voor deze studie.
CM-H 2 DCFDA is ook bekend als 2 ', 7'-dichloorfluoresceïne en H2DCF. CM-H 2 DCFDA is een cel-permeabele indicator voor de aanwezigheid van reactieve zuurstof species. CM-H 2 DCFDA komt in de cel als een niet-fluorescerende verbinding, die wordt fluorescerende na cellulaire esterases verwijder de acetaat groepen, en de verbinding wordt geoxideerd. Eenmaal in de cel en de acetaat groepen zijn verwijderd, kan de CM-H 2 DCFDA geoxideerd worden door een aantal ROS soorten, waaronder stikstofoxide, peroxynitriet anionen, waterstofperoxide en organische hydroperoxiden 3, 14, 25, wat resulteert in een groene fluorescerend product 23, 28. Dit gebrek aan te geven in de ROS, die CM-H 2 DCFDA oxideren, maakt het een waardevol reagens in de vroege stadia van een pathogenese onderzoek, waarin een oxidatieve stress mechanisme wordt verondersteld om een rol te spelen, maar het is onbekend welke zuurstof radicaal kunnen hierbij worden betrokken, in plaats van te testen voor elke ROS afzonderlijk. Zodra is vastgesteld dat ROS aanwezig zijn door oxidatie van CM-H 2 DCFDA, dan is extra experimenten kunnen worden uitgevoerd om te bepalen, welke ROS of combinatie van Ross zijn betrokken bij de pathogenese bijzonder proces. De resultaten van deze huidige studie tonen aan dat met de toevoeging van waterstofperoxide een toename van de CM-H 2 DCFDA fluoresceren werd gedetecteerd in vergelijking met de controle met fysiologische zoutoplossing, wat aangeeft dat deze test is waardevolle test voor het detecteren van een oxidatieve omgeving binnen de G355-5 cellen, een katachtige astrocyten cellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij danken ReadiSorb Producten voor hun genereuze steun van deze studies.
Acknowledgments
Wij danken ReadiSorb Producten voor hun genereuze steun van deze studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M.
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
