Summary
Um método de triagem para detectar ambientes oxidativo celular é medir a oxidação do CM-H2DCFDA. Uma vez oxidada dentro de uma célula, CM-H2DCFDA muda de não-fluorescentes em um composto fluorescente. Esta mudança de fluorescência é medida por citometria de fluxo e indica o número de células em um ambiente oxidativo.
Abstract
Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo. Astrócitos têm um papel importante no controle do estresse oxidativo do Sistema Nervoso Central (SNC). Astrócitos ajudar a manter um ambiente homeostático para os neurônios, assim como proteger os neurônios de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). CM-H2DCFDA é um indicador de células-permeável para a presença de ROS. CM-H 2 DCFDA entra na célula como um composto não-fluorescente, e se torna fluorescente após esterases celulares remover os grupos acetato, eo composto é oxidado. O número de células, medido por citometria de fluxo, que são encontrados para ser fluorescentes verde é uma indicação do número de células que estão em um estado oxidativo. CM-H 2 DCFDA é suscetível à oxidação por um grande número de ROS diferente. Esta falta de especificidade, considerando que ROS pode oxidar CM-H 2 DCFDA, faz deste composto um regente valiosa para uso nas fases iniciais de uma investigação patogênese, como este teste pode ser usado para a tela para um ambiente oxidativo celular, independentemente do que o oxigênio radical ou combinação de ROS são responsáveis pelas condições celular. Uma vez que foi estabelecido que ROS estão presentes por oxidação de DCFDA 2 CM-H, em seguida, experimentos adicionais podem ser realizados para determinar qual ROS ou combinação de EROs estão envolvidas no processo de patogênese particular. Os resultados deste estudo demonstram que com a adição de peróxido de hidrogênio em um aumento DCFDA 2 CM-H fluorescência foi detectada em relação aos controles salina, indicando que este teste é um teste útil para a detecção de um ambiente oxidativo dentro G355-5 células, uma linhagem celular felina astrócitos.
Protocol
1. Cultura de células de astrócitos felino e tratamento com H 2 O 2
- Linha de cultura de células G355-5 em um balão de 75 cm 2 com a mídia DMEM acrescido de nutrientes, a 37 ° C e 5% de CO 2 até confluentes 60% (~ 5 dias). Substituir a mídia a cada 1-2 dias ou quando necessário para manter uma cultura saudável.
- Remova a mídia e adicionar 2 ml de tripsina 0,25%. Levante as células por pipetagem por 45 s - 1 min à temperatura ambiente (RT).
- Rapidamente transferir a suspensão para um tubo cônico de 15 ml contendo 10 ml de mídia. Misture delicadamente.
- Centrifugar a 300 xg, 23 ° C por 3 min para obter uma pelota. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Adicionar ml 6-7 de mídia fresco e ressuspender as células.
- Adicionar ~ 1 ml de células para cada poço de uma placa de seis poços. Adicionar 2-3 ml de mídia para cada poço e incubar até confluentes 80-90%.
- Prepare uma solução 100μM de peróxido (H 2 O 2) na mídia.
- Remova a mídia de cada bem e substituir com 2 ml de mídia fresco (controle), 2 ml de H 2 O 2 (tratamento) ou 2 ml de DPBS. Incubar a 37 ° CO C, 5 2% para 3 h.
- Remover soluções e adicionar 1 ml de tripsina para levantar as células. Transferência de células para um tubo Eppendorf 1,7 ml contendo 0,5 ml DPBS. Esta etapa deve ser realizada em cada poço individualmente, a fim de evitar a morte celular de incubação de tripsina prolongada.
- Giram a 300 xg por 3 min, descartar o. Sobrenadante e ressuspender em 1 ml de DPBS
2. Coloração de ROS
- Todos os passos para a coloração deve ser realizada com a exposição à luz mínima para prevenir branqueamento.
- Adicionar 1 ml de 50 mM CCCP ao controle positivo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 5 min.
- Adicionar 5 mL de uma solução de 10 mM CM-H DCFDA 2 à H 2 O 2 grupo. Incubar a 37 ° C, 5% CO 2 por 15-30 min. Sem mancha é adicionado à amostra salina.
- Lavar as amostras com 2 ml de DPBS para remover mancha residual.
- Giram a 300 xg por 3 min para obter uma pelota.
- Ressuspender as células em 0,5 ml de DPBS. Adicionar 1 mL PI para cada amostra, com exceção do soro fisiológico.
- Transferência de amostras para um tubo de 5ml de fluxo citómetro.
- Executar no citômetro de fluxo.
3. Citometria de fluxo
- Executar amostras em um Beckman Coulter FC500 (ou equivalente) equipado com um laser de argônio 488 nm ea banda passa a seguir: 525, 775 e 620 nm, todas ± 20 nm.
- Prepare os controles apropriados: não coloridas, CM-H 2 DCFDA manchada apenas, PI só, manchado dupla (controle negativo).
- Faça um protocolo que tem o histoplots seguinte: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Ele também deve ter os histogramas seguintes: número de células versus FL1, FL2 e FL3, o que corresponde às manchas.
- Antes de executar as amostras, verificar o equipamento, fluidos e recipiente de resíduos. Aquecer o equipamento para, pelo menos, 20 min.
- Limpar o equipamento e realizar uma calibração com as contas apropriadas de acordo com os padrões dos fabricantes.
- Selecione seu protocolo e executar os exemplos.
- Limpar o equipamento, como feito anteriormente.
- Limpar a linha de vácuo acordo com as normas dos fabricantes.
- Desligue o fluxo e limpar a linha da cabeça / vácuo.
- Desligue o software eo computador.
4. Resultados representativos:
Resultados de citometria de fluxo foram analisados utilizando programa FlowJo 7,6 e os controles mancha foram usados para objetivamente definir o gating. Com base nisso, as células saudáveis aparecem à esquerda do histograma e ROS (estresse oxidativo) foi detectado como uma mudança de células para a direita. A Figura 1 mostra os resultados do efeito do peróxido de hidrogênio em astrócitos saudáveis felino. Dados de FL1 foi usado para medir a intensidade da DCFDA 2 CM-H, que indica a presença de ROS. Como esperado, uma maior quantidade de ROS foi detectado na amostra tratada com H 2 O 2. Isso é exibido no histograma como uma mudança na intensidade de fluorescência da esquerda para a direita. Ao comparar as células saudáveis tratados com DMEM versus DPBS, não houve mudança significativa na quantidade de ROS (Fig. 2).
Figura 1. Fluxo de resultados de citometria de níveis de estresse oxidativo em astrócitos saudáveis felina eo efeito do H 2 O 2 em células saudáveis. Os resultados indicam que H 2 O 2 aumenta os níveis de ROS em células saudáveis, em comparação com as células sem tratamento (DMEM).
Figura 2. Fluxo Citometria de resultados de níveis de ROS detectado em células saudáveis incubados por 3 horas com DPBS.
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Discussion
Um mecanismo muitas vezes sugerido de vírus danos induzidos neuronal é o estresse oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Basicamente, propõe-se que através da exposição viral da glia (astrócitos e microglia) liberação de radicais de oxigênio reativo, tais como, hidróxido, ânion superóxido, óxido nítrico, e / ou peróxido de hidrogênio, que são tóxicos para os neurônios. Da mesma forma, o estresse oxidativo também tem sido sugerido como um mecanismo patológico em grandes metanfetamina neurotoxicidade induzida pelo 2, 6, 17. Uma vez que nosso grupo está interessado nos efeitos de ambos os vírus e drogas de abuso sobre o SNC, que optou por usar um teste de rastreio rápido para determinar o presente de ROS excesso de astrócitos. A maioria de glutationa neuronal é produzido pela astrócitos e, em seguida, entregues aos neurônios 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Assim, o papel astrócitos do estresse oxidativo é importante para manter um ambiente homeostático para os neurônios, bem como proteger os neurônios de ROS, e é a razão que culturas de células astrócitos foram escolhidos para este estudo.
CM-H 2 DCFDA também é conhecido como 2 ', 7'-diclorofluoresceína e H2DCF. CM-H 2 DCFDA é um indicador de células-permeável para a presença de espécies reativas de oxigênio. CM-H 2 DCFDA entra na célula como um composto não-fluorescente, que se torna fluorescente após esterases celulares remover os grupos acetato, eo composto se torna oxidado. Uma vez dentro da célula e os grupos de acetato são removidos, o CM-H 2 DCFDA pode ser oxidado por um número de espécies de ROS, incluindo o óxido nítrico, peroxinitrito ânions, peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos 3, 14, 25, resultando em um verde fluorescentes produto 23, 28. Esta falta de especificar no ROS, que podem oxidar CM-H 2 DCFDA, faz com que seja um reagente valiosa nos estágios iniciais de uma investigação patogênese, no qual um mecanismo de estresse oxidativo é acreditado para ser um papel, mas não se sabe qual de radicais de oxigênio podem estar envolvidos, ao invés de teste para cada um separadamente ROS. Uma vez que foi estabelecido que ROS estão presentes por oxidação de DCFDA 2 CM-H, em seguida, experimentos adicionais podem ser realizados para determinar, que ROS ou combinação de EROs estão envolvidas no processo de patogênese particular. Os resultados deste estudo demonstram que com a adição de peróxido de hidrogênio em um aumento DCFDA 2 CM-H fluorescência foi detectada quando comparado ao controle salina, indicando que que este teste é um teste útil para a detecção de um ambiente oxidativo dentro do G355-5 células, uma linhagem celular felina astrócitos.
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Disclosures
Agradecemos Produtos ReadiSorb por seu generoso apoio desses estudos.
Acknowledgments
Agradecemos Produtos ReadiSorb por seu generoso apoio desses estudos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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