Summary
Oksidatif hücresel ortamlarda tespit etmek için bir tarama yöntemi, CM-H2DCFDA oksidasyon ölçmek için. Bir kez floresan olmayan bir floresan bileşik bir hücre, CM-H2DCFDA değişiklikler içinde okside. Bu değişiklik, floresan flow sitometri ile ölçüldü ve oksidatif bir ortamda hücrelerin sayısını gösterir.
Abstract
Nöronal hasara neden bir virüs sık önerilen mekanizma oksidatif stres. Astrositler Santral Sinir Sistemi (MSS) oksidatif stres kontrolünde önemli bir role sahip. Astrositler Reaktif Oksijen Ürünleri (ROS) nöronların yanı sıra korumaya nöronlar için homeostatik çevre korumaya yardımcı olmak. CM-H2DCFDA ROS varlığı için bir hücre geçirgen bir göstergesi. CM-H 2 DCFDA hücre floresan olmayan bir bileşik olarak girer ve hücresel esterazlar asetat grupları kaldırdıktan sonra floresan olur ve bileşik okside . Yeşil floresan olarak bulundu flow sitometri ile ölçülen hücreler, hücreleri oksidatif bir devlet sayısı bir göstergesidir. CM-H 2 DCFDA çok sayıda farklı ROS oksidasyona duyarlıdır. Bu testte ne olursa olsun, hangi oksijen ekrana oksidatif hücresel bir çevre için kullanılacak gibi ROS CM-H 2 DCFDA okside edebilir ilişkin özgüllük Bu eksikliği, bu bileşiğin bir patogenezinde soruşturmasının ilk aşamalarında kullanmak için değerli bir naip yapar ROS radikal ya da kombinasyon hücresel koşulları için sorumludur. Bir kere ROS, CM-H 2 DCFDA oksidasyonu ile mevcut sonra ek deneyler ROS veya Ross birlikte özellikle patogenezinde sürecinde yer aldığı belirlemek için yapılabilir olduğunu kurulmuştur. Bu çalışmanın sonuçları, bu testte G355-5 hücre içinde oksidatif ortamda tespit etmek için değerli bir test, bir olduğunu belirten, hidrojen peroksit CM-H 2 DCFDA bir artış ilavesi ile, tuzlu kontrollere göre tespit edildi floresan olduğunu göstermek kedi astrosit hücre hattı.
Protocol
1. Hücre kültürü ve kedi astrositler H 2 O 2 ile tedavi
- 37 DMEM medya artı besin ile 75 cm 2 balon Kültür hücre hattı G355-5 ° C ve% 5 CO2,% 60 konfluent kadar (~ 5 gün) . Her 1-2 günde bir medya değiştirin ya da sağlıklı bir kültürü korumak için gerekli.
- Medya çıkarın ve 2 ml% 0.25 tripsin ekleyin. 45 s pipetleme hücreleri Asansör - 1 dakika oda sıcaklığında (RT).
- Süspansiyon, 10 ml medya içeren bir 15 ml konik tüp hızla aktarın. Yavaşça karıştırın.
- Bir pelet elde etmek için 300 xg, 23 ° C'de 3 dakika santrifüjleyin. Pelet bozmadan süpernatantı atın.
- 6-7 ml taze medya ekleyin ve hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
- 6 plaka her kuyuya hücre ~ 1 ml ekleyin. 2-3 ml medya her iyi ve% 80-90 konfluent kadar inkübe edin.
- Medyada 100μM çözüm peroksit (H 2 O 2) hazırlayın.
- Her iyi ortamı çıkarın ve ya 2 ml taze medya (kontrol), H 2 O 2 (tedavi) veya DPBS 2 ml 2 ml ile değiştirin. 37 ° C,% 5 CO 2 3 saat boyunca inkübe
- Çözümler çıkarın ve hücreleri kaldırmak için 1 ml tripsin ekleyin. 0.5 ml DPBS içeren 1.7 ml Eppendorf tüp hücreleri aktarın. Bu adım, uzun süre tripsin kuluçka hücre ölümü önlemek için her yanı ayrı ayrı yapılmalıdır.
- 3 dakika boyunca 300 xg'de Spin atın DPBS 1 ml supernatant ve tekrar süspansiyon.
2. ROS için Boyama
- Boyama için tüm adımları beyazlatma önlemek için az ışığa maruz kalma ile yapılmalıdır.
- Pozitif kontrol için 50 mM CCCP 1 ul ekleyin. 37 ° ° C'de,% 5 CO 2 5 dakika boyunca.
- H 2 O 2 grup 10 mM CM-H 2 DCFDA çözüm 5 ul ekleyin. 37 ° ° C'de,% 5 CO 2, 15-30 dk . Leke tuzlu örnek eklenir.
- Artık leke çıkarmak için DPBS 2 ml örnek yıkayın.
- Bir pelet elde etmek için 3 dakika boyunca 300 xg'de Spin.
- DPBS 0.5 ml hücreleri tekrar Tuzlu su hariç, her bir örnek için 1 ul PI ekleyin.
- 5ml akış sitometresinin tüp numune aktarın.
- Akış sitometresinde çalıştırın.
3. Flow sitometri
- 525, 775 ve 620 nm ± 20 nm: 488 nm argon lazer ve aşağıdaki bant geçer ile donatılmış bir Beckman Coulter FC500 (veya eşdeğeri) örnek çalıştırın.
- Uygun kontrollerin hazırlayın: lekesiz hücreleri, CM-H 2 DCFDA (negatif kontrol) PI, sadece çift lekeli, sadece boyanmış.
- : Aşağıdaki histoplots FS vs SS, PI vs. CM-H 2 DCFDA bir protokol olun . Ayrıca aşağıdaki histogramlar olmalıdır: lekeleri karşılık gelen hücre sayısı vs FL1, FL2 ve FL3.
- Örnekleri çalıştırmadan önce, ekipman, sıvıları ve atık kabını kontrol edin. Isınma en az 20 dakika için donatım.
- Temizleyin ve ekipman üreticileri standartlara göre uygun boncuklar ile bir kalibrasyon gerçekleştirmek.
- Protokolü seçin ve numunelerinin çalışılabilmesi için.
- Daha önce de yaptığımız gibi araçları temizleyiniz.
- Üreticileri standartlara göre vakum hattı temizleyin.
- Akış kapatın ve baş / vakum hattı temiz.
- Yazılım ve bilgisayarı kapatın.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Flow sitometri sonuçları FlowJo 7.6 ve leke kontrolleri yolluk objektif ayarlamak için kullanılır kullanılarak analiz edildi. Buna göre, sağlıklı hücreleri histogram ve ROS (oksidatif stresi) sol görünür bir hücre sağa doğru kayması olarak tespit edildi. Şekil 1 hidrojen peroksit etkisi ile sağlıklı bir kedi astrositler sonuçlarını gösterir. FL1 elde edilen veriler, ROS varlığını gösterir CM-H 2 DCFDA yoğunluğunu ölçmek için kullanılır oldu . Beklendiği gibi, daha yüksek bir miktarda ROS H 2 O 2 ile tedavi örneği tespit edildi. Bu soldan sağa doğru bir kayma floresan yoğunluğu olarak histogram görüntülenir. DMEM karşı DPBS ile tedavi edilen sağlıklı hücreleri karşılaştırarak, ROS miktarını (Şekil 2) anlamlı bir değişiklik yoktu.
Şekil 1, oksidatif stres seviyeleri ve sağlıklı kedi astrositler, sağlıklı hücreler üzerinde H 2 O 2 etkisi Flow sitometri sonuçları. H 2 O 2 hücreleri hiçbir tedavi (DMEM) ile karşılaştırıldığında sağlıklı hücreler ROS düzeylerini artırdığını göstermektedir.
Şekil 2 DPBS ile 3 saat inkübe sağlıklı hücreleri tespit ROS düzeyleri Sitometrisi sonuçları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virüs sıklıkla önerilen bir mekanizma, nöronal hasara oksidatif stres 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31 neden olmuştur. Temelde, önerilen hidroksit, süperoksit anyon, nitrik oksit ve / veya nöronlar için toksik olan hidrojen peroksit, viral maruz kalma yoluyla glia (astrositler ve mikroglia) serbest reaktif oksijen radikalleri. Benzer şekilde, oksidatif stres de metamfetamin indüklenen nörotoksisite 2, 6, 17 büyük bir patolojik mekanizma olarak öne sürülmüştür. Grubumuzun etkileri MSS kötüye virüs ve uyuşturucu hem de ilgi olduğundan, biz astrositlerde aşırı ROS mevcut belirlemek için hızlı bir tarama testi kullanmak için seçti. Nöronal glutatyon çoğunluğu astrositler tarafından üretilen ve nöronlar 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30 sonra teslim edilir. Böylece, oksidatif stres astrositler rol nöronlar için bir homeostatik işletebilmenin ROS gelen nöronların korunması gibi önemli ve astrosit hücre kültürleri bu çalışma için seçilmiştir nedeni budur.
CM-H 2 DCFDA 2 ', 7'-dichlorofluorescein ve H2DCF olarak da bilinir. CM-H 2 DCFDA reaktif oksijen türlerinin varlığı için bir hücre geçirgen bir göstergesi . CM-H 2 DCFDA hücre, hücresel esterazlar asetat grupları kaldırdıktan sonra floresan olur olmayan bir floresan bileşik olarak girer ve bileşik okside olur . Bir kez hücre ve asetat grupları içinde kaldırılır, CM-H 2 DCFDA yeşil, nitrik oksit, peroksinitrit anyon, hidrojen peroksit ve organik hidroperoksitler 3, 14, 25, ROS türlerin sayısına göre okside olabilir floresan ürünü 23, 28. Bu eksiklik, CM-H 2 DCFDA okside olan ROS belirlediğiniz bir rol oynayan bir oksidatif stres mekanizması olduğuna inanılıyor hangi bir patogenezinde araştırma, erken aşamalarında değerli bir reaktif yapar, ancak hangi bilinmiyor radikal oksijen yerine her ROS ayrı ayrı test yer olabilir. Bir kere ROS ROS veya Ross birlikte özellikle patogenez süreci dahil CM-H 2 DCFDA ek deneyler, daha sonra belirlemek için yapılabilir, oksidasyonu mevcut olduğunu kurulmuştur. Serum fizyolojik kontrol etmek kıyaslandığında bu çalışmanın sonuçlarını gösteren, hidrojen peroksit CM-H 2 DCFDA bir artış ilavesi ile tespit edildi floresan olduğunu göstermektedir ki bu testte G355-5 oksidatif içinde bir ortamda tespit etmek için değerli bir test olduğunu hücreleri, bir kedi astrosit hücre hattı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz, cömert destek için bu çalışmaların ReadiSorb Ürünler teşekkür ederiz.
Acknowledgments
Biz, cömert destek için bu çalışmaların ReadiSorb Ürünler teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M. Neuropathogenesis of AIDS. Mol Med Today. 2, 16-23 (1996).
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
