Summary
Une méthode de dépistage pour détecter des environnements cellulaires oxydatif est de mesurer l'oxydation de la CM-H2DCFDA. Une fois oxydé dans une cellule, le CM-H2DCFDA changements de la non-fluorescente en un composé fluorescent. Ce changement de fluorescence est mesurée par cytométrie en flux et indique le nombre de cellules dans un milieu oxydant.
Abstract
Un mécanisme souvent suggéré de virus induit des lésions neuronales est le stress oxydatif. Les astrocytes ont un rôle important dans le contrôle du stress oxydatif du Système Nerveux Central (SNC). Les astrocytes aider à maintenir un environnement homéostatique des neurones ainsi que des neurones à partir de protéger les espèces réactives de l'oxygène (ERO). CM-H2DCFDA est un indicateur de cellules perméables à la présence des ROS. CM-H 2 DCFDA pénètre dans la cellule comme un composé non fluorescent, et devient fluorescent après estérases cellulaires éliminer les groupes acétate, et le composé est oxydé. Le nombre de cellules, mesurée par cytométrie en flux, qui sont jugés fluorescent vert est une indication du nombre de cellules qui sont dans un état d'oxydation. CM-H 2 DCFDA est sensible à l'oxydation par un grand nombre de différents ROS. Ce manque de spécificité, au sujet desquels les ROS peuvent s'oxyder CM-H 2 DCFDA, rend ce composé un régent précieux pour l'utilisation dans les premiers stades d'une enquête pathogenèse, comme ce test peut être utilisé pour dépister un environnement oxydatif cellulaire indépendamment de laquelle l'oxygène radicale ou une combinaison de ROS sont responsables des conditions cellulaires. Une fois qu'il a été établi que les ROS sont présents par oxydation du CM-H 2 DCFDA alors des expériences supplémentaires peuvent être effectuées pour déterminer les ROS ou combinaison de Ross sont impliqués dans le processus de pathogénie particulière. Les résultats de cette étude démontrent que grâce à l'ajout de peroxyde d'hydrogène une augmentation de la CM-H 2 DCFDA fluorescence n'a été détectée par rapport aux contrôles saline, ce qui indique que ce test est un test utile pour détecter un environnement oxydatif dans les cellules G355-5, un féline lignée d'astrocytes.
Protocol
1. La culture cellulaire d'astrocytes féline et le traitement par H 2 O 2
- Lignée cellulaire Culture G355-5 dans un flacon de 75 cm2 avec les médias DMEM plus nutriments à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à confluence de 60% (~ 5 jours). Remplacer les médias tous les 1-2 jours ou au besoin pour maintenir une culture saine.
- Retirez le support et ajouter 2 ml de trypsine à 0,25%. Soulevez les cellules par pipetage pour 45 s - 1 min à température ambiante (RT).
- Transférez rapidement la suspension d'un tube de 15 ml conique contenant 10 ml de médias. Mélanger délicatement.
- Centrifuger à 300 xg, 23 ° C pendant 3 min pour obtenir un culot. Jeter le surnageant sans perturber le culot.
- Ajouter ml 6-7 de milieux frais et de remettre en suspension les cellules.
- Ajouter environ 1 ml de cellules dans chaque puits d'une plaque de 6 puits. Ajouter 2-3 ml de milieu dans chaque puits et incuber jusqu'au confluent de 80-90%.
- Préparer une solution de peroxyde 100 microns (H 2 O 2) dans les médias.
- Retirez le support de chaque puits et les remplacer avec soit 2 ml de milieu frais (contrôle), 2 ml de H 2 O 2 (traitement) ou 2 ml de DPBS. Incuber à 37 ° C CO, 5% 2 pour 3 h.
- Retirer des solutions et ajouter 1 ml de trypsine à lever les cellules. Transfert des cellules dans un tube de 1,7 ml Eppendorf contenant 0,5 ml DPBS. Cette étape doit être effectuée sur chaque bien individuellement afin de prévenir la mort cellulaire à partir d'incubation prolongée trypsine.
- Centrifuger à 300 xg pendant 3 minutes, jetez la. Surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de DPBS
2. Coloration pour ROS
- Toutes les étapes pour la coloration doit être effectuée avec exposition à la lumière minimale afin de prévenir le blanchiment.
- Ajouter 1 ul de 50 mM à CCCP le contrôle positif. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 5 min.
- Ajouter 5 pi d'un 10 mm CM-H 2 solution DCFDA à l'H 2 O 2 du groupe. Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant 15-30 min. Aucune tache est ajouté à l'échantillon une solution saline.
- Lavez échantillons avec 2 ml de DPBS pour enlever taches résiduelles.
- Centrifuger à 300 xg pendant 3 minutes pour obtenir un culot.
- Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de DPBS. Ajouter une PI ul à chaque échantillon, à l'exception de la saline.
- Transfert des échantillons à un tube de 5ml cytomètre en flux.
- Exécuter sur le cytomètre en flux.
3. La cytométrie en flux
- Exécuter des échantillons sur une FC500 Beckman Coulter (ou équivalent) équipé d'un laser à 488 nm argon et la bande de passe suivants: 525, 775 et 620 nm, tous les 20 ± nm.
- Préparer les contrôles appropriés: cellules non colorées, CM-H 2 DCFDA taché seulement, seul IP, teinté double (témoin négatif).
- Faire un protocole qui a le histoplots suivantes: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Il devrait également avoir les histogrammes suivants: le nombre de cellules vs FL1, FL2 et FL3, ce qui correspond à la tache.
- Avant d'exécuter les échantillons, vérifier l'équipement, des fluides et conteneur à déchets. Warm up de l'équipement pendant au moins 20 min.
- Nettoyer l'équipement et effectuer un calibrage avec les perles appropriée selon les normes des fabricants.
- Sélectionnez votre protocole et d'exécuter les échantillons.
- Nettoyer le matériel comme précédemment.
- Nettoyer la ligne de vide selon les normes des fabricants.
- Eteignez le flux et nettoyer la ligne de tête / vide.
- Eteignez le logiciel et l'ordinateur.
4. Les résultats représentatifs:
Résultats de cytométrie en flux ont été analysées à l'aide FlowJo 7.6 et les contrôles ont été utilisés pour tache de définir objectivement le fenêtrage électronique. Sur cette base, les cellules saines apparaissent sur la gauche de l'histogramme et les ROS (stress oxydatif) a été détecté comme un changement de cellules vers la droite. La figure 1 montre les résultats de l'effet du peroxyde d'hydrogène sur la santé des astrocytes félin. Les données de FL1 a été utilisé pour mesurer l'intensité de CM-H 2 DCFDA, qui indique la présence de ROS. Comme prévu, un montant plus élevé de ROS a été détectée dans l'échantillon traité avec H 2 O 2. Ceci est affichée sur l'histogramme comme un changement dans l'intensité de fluorescence de gauche à droite. Lorsque l'on compare les cellules saines traitées avec du DMEM par rapport DPBS, il n'y avait aucun changement significatif dans la quantité de ROS (Fig 2).
Figure 1. Les résultats de cytométrie en flux des niveaux de stress oxydatif dans les astrocytes sains féline et l'effet de H 2 O 2 sur les cellules saines. Les résultats indiquent que H 2 O 2 augmente les niveaux de ROS dans les cellules saines par rapport aux cellules sans traitement (DMEM).
Figure 2. Résultats cytométrie de flux de niveaux de ROS détecté dans les cellules saines incubés pendant 3h avec du DPBS.
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Discussion
Un mécanisme suggère souvent de virus induit des lésions neuronales est le stress oxydatif 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Fondamentalement, il est proposé que l'exposition virale de la glie (astrocytes et microglie) radicaux communiqué réactives de l'oxygène tels que l'hydroxyde, l'anion superoxyde, l'oxyde nitrique, et / ou le peroxyde d'hydrogène, qui sont toxiques pour les neurones. De même, le stress oxydatif a également été suggéré comme un mécanisme majeur pathologique dans la neurotoxicité induite par la méthamphétamine 2, 6, 17. Depuis notre groupe est intéressé par les effets de ces deux virus et l'abus des drogues sur le SNC, nous avons choisi d'utiliser un test de dépistage rapide pour déterminer le présent de l'excès de ROS dans les astrocytes. La majorité des neurones glutathion est produit par les astrocytes et ensuite livrés à des neurones 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Ainsi, le rôle des astrocytes dans le stress oxydatif est importante pour maintenir un environnement homéostatique des neurones ainsi que la protection des neurones à partir de ROS, et c'est la raison que les cultures de cellules astrocytaires ont été choisis pour cette étude.
CM-H 2 DCFDA est également connu comme 2 ', 7'-dichlorofluorescéine et H2DCF. CM-H 2 DCFDA est un indicateur de cellules perméables à la présence d'espèces réactives de l'oxygène. CM-H 2 DCFDA pénètre dans la cellule comme un composé non fluorescent, qui devient fluorescent après estérases cellulaires éliminer les groupes acétate, et le composé devient oxydé. Une fois dans la cellule et les groupes acétate sont retirés, le CM-H 2 DCFDA peut être oxydé par un certain nombre d'espèces ROS, y compris l'oxyde nitrique, anions peroxynitrite, le peroxyde d'hydrogène et les hydroperoxydes organiques 3, 14, 25, résultant en un vert produit fluorescent 23, 28. Ce manque de préciser dans le ROS, qui peut oxyder CM-H 2 DCFDA, rend un réactif précieux dans les premiers stades d'une enquête pathogenèse, dans laquelle un mécanisme de stress oxydatif est considéré comme jouant un rôle, mais on ne sait où radicaux d'oxygène pourrait être impliqué, plutôt que de test pour chacun séparément ROS. Une fois qu'il a été établi que les ROS sont présents par oxydation du CM-H 2 DCFDA, puis des expériences supplémentaires peuvent être effectuées pour déterminer qui ROS ou une combinaison de Ross sont impliqués dans le processus de pathogénie particulière. Les résultats de cette étude démontrent que grâce à l'ajout de peroxyde d'hydrogène une augmentation de la CM-H 2 DCFDA fluorescence n'a été détectée par rapport à la solution saline de contrôle, indiquant que ce test est le test utile pour détecter un environnement oxydatif dans le G355-5 cellules, une lignée cellulaire féline astrocytes.
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Disclosures
Nous remercions les produits ReadiSorb pour leur généreux soutien de ces études.
Acknowledgments
Nous remercions les produits ReadiSorb pour leur généreux soutien de ces études.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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