Summary
循环压力的心脏瓣膜组织遭受的生理和病理的压力条件下的生物反应器已经设计。一个LabVIEW程序允许用户控制压力的大小，幅度和频率。此装置可用于研究心脏瓣膜组织或孤立的细胞mechanobiology。
Abstract
主动脉瓣，左心室和主动脉之间，允许单向血流量，防止回流入脑室。主动脉瓣叶内细胞外基质（ECM）暂停，内衬内皮细胞单层的间质细胞组成。该阀门可承受苛刻的，动态的环境和不断暴露剪切，前屈，张力和压缩。研究表明病变瓣膜钙化病变发生在机械应力高的地区作为内皮细胞破坏或间质性基质损害 1-3的结果。因此，这并不奇怪，流行病学研究表明高血压，要在一个主要危险因素的主动脉瓣病变 4的发生。
目前瓣膜病唯一的治疗选择是一个bioprosthetic或机械瓣膜病变瓣膜置换手术。物理讲改进阀生物学的了解将有助于阐明阀的发病机制。反过来，这将有助于在非侵入性治疗，如医药干预或预防的发展。几个生物反应器，此前已开发研究本地或工程心脏瓣膜6-9 mechanobiology。脉动生物反应器也已发展到包括软骨，骨 11 10和12膀胱组织的研究范围。这项工作的目的是发展循环压力系统，可以用来澄清压力负荷增加的主动脉瓣叶的生物反应。
该系统由丙烯酸商会在其中放置样品和生产循环的压力，氟橡胶膜片电磁阀控制压力周期的时间，和一台计算机来控制电气设备。压力监测使用的压力传感器，空调使用的信号是一个负载单元空调。一个LabVIEW程序规范使用模拟设备系统，在适当的速度泵入压缩空气的压力。该系统模仿与主动脉瓣跨瓣压差的动态水平;一个锯齿波产生的压力逐渐增加，典型的是目前在舒张期，阀门两端的跨瓣压差梯度，压力急剧描绘阀门的开度在下降收缩。 LabVIEW程序允许用户控制循环压力的大小和频率。该系统能够受到生理和病理的压力条件下的组织样本。此设备可用于增加心脏瓣膜如何应对在当地的机械环境的变化的认识。
Protocol
1。组织收获和准备
- 应收集称重后立即死亡的不超过120磅的成年猪主动脉瓣。
- 阀门两次洗净，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和运输上冰实验室。
- 应在无菌条件下进行的所有后续步骤。
- 确保，单张不显示任何退化的迹象，撕裂或钙化。删除从纤维环削减1 / 3的距离从主动脉根部的宣传单张。
- 放置传单，在六孔板个别井和3毫升贝科改良Eagle 1％anti-biotic/anti-mycotic解决方案，并在37 ° C和5％的CO 2 10％胎牛血清培养基孵育过夜。
- 作为一种替代方法，分离出的细胞可以接种到6孔培养板，压力设备中使用的。如前所述13，14阀内皮细胞和间质细胞的分离，可以进行。
2。压力研究
- 一个特制的压力系统的设计研究循环压力的主动脉瓣组织15 mechanobiological影响。
- 登录到计算机上，打开LabVIEW程序（图1）。
- 校准：
- 试验之前，该系统应正确校准。
- 连接到电路板的电源。这提供电源的电磁阀控制流入和流出的空气室的流动。
- 确保压缩空气系统连接，并打开送风全速度。
- 开启的信号放大器。确保电压读数是0.00。根据需要调整
- LabVIEW的接口标有“测试/记录”的一个开关。确保将开关设置为“test”。点击标有“空气补给”，打开进水电磁阀“按钮。
- 使用燃气压力调节器，用压缩空气加压室1 PSI。在会议厅内的压力可以读取使用位于室的后端板的数字压力表。一旦压力平衡，记录信号放大器的电压读数。重复2，3，4和5 PSI。
- 构建的压力与电压的校准曲线。压力应该从PSI的转换，以毫米汞柱。从图中的计算公式可以被放置到LabVIEW程序代码
- 从压力室中删除的铝制前板和喷雾室，用70％乙醇。至少10分钟离开，让残留的乙醇气体消散。
- 将6孔板单张样本含有进入会议厅和更换前端板。确保密封不透气收紧位于四个螺纹杆（位于终板的每个角落）手工坚果。将在37℃孵化器压力室。一个压力室的示意图如图2所示。
- 该界面会提示用户提供的压缩空气输入和输出之间的时间系统周期量。这些应设置为0.6S和0.4秒模仿的舒张压和收缩压的条件下，分别在频率为1Hz，。用户还应该输入数据文件的路径。
- 在LabVIEW中，单击“运行”和“测试/记录”切换开关“录制”。
- 确保在使用LabVIEW的接口图所需的水平压力。压力可以调整使用的燃气调压。
- 运行程序所需的时间长度。
- 一旦实验完成后，单击“基于LabVIEW的停止按钮，关掉供气，打开排气阀上的压力室。
- 从室取出前端板和检索六孔板样品。现在可以分析基因表达，蛋白表达，组织学，力学性能等样品
3。代表性的成果：
压力系统是能够模拟正常血压下观察到的最大跨瓣压力，阶段I和第II阶段的高血压的条件。然而，压力是不能够模仿的收缩压梯度，这基本上是零，在体内。保持以1Hz的频率，0.6S的进气口和排气时间的0.4秒时间。代表从系统中获得的条件正常和压力升高的压力波形图3中可以看出。
图1：LabVIEW的接口的屏幕截图。
图2：A.压力腔压力腔等轴测视图示意图; B.压力室的侧视图;C.压力室的顶视图。
图3：图内的压力腔的压力模拟（一）血压正常，（二）第一阶段高血压，和（C）第二阶段高血压条件。
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Discussion
压力系统成功地暴露了主动脉瓣舒张期跨瓣压差，分别代表循环压力。然而，这是不能够模仿收缩跨瓣压差，压力仅下降40毫米汞柱。跨瓣压差在升主动脉和左心室之间的压力差。在舒张期，当阀门关闭时，压力差是80mmHg血压正常的条件下和90毫米汞柱，并在第一阶段100mmHg我和第二阶段的高血压，分别为。在收缩过程中，当阀门打开时，左心室和主动脉之间的压力差为零。发生在主动脉瓣病变的细胞变化，被认为是高舒张压相关联，因此，其实压力没有降至零，未必是一个重大问题。这是基于假设，这是压力的大小和没有压力的幅度，是生物反应背后的驱动力。从100毫米汞柱的压力降低到0毫米汞柱，需要1.20 ± 0.04s，从20个压力周期的数据分析报告。由于主动脉瓣关闭的时间是心动周期的约2 / 3，大量涌入的压力室的空气进入就需要2.4s创建阀门的开度相同的平衡和闭幕式在生理条件下经历。因此，为0.28赫兹的频率将用于测试的收缩压和舒张压瓣主动脉瓣mechanobiology压力水平的影响。但是，如果收缩压和舒张压的跨瓣压差在生理频率为1 Hz，真空泵和水库模拟，可以安装排气电磁阀。真空泵可以删除一个固定数额的压力，使排气阀打开时，完全减少设定的压力水平的压力所需的空气量会被卷入真空水库。拆除的压力将创建一个0毫米汞柱环境，收缩期跨瓣压差的代名词。反之，当排气阀关闭，真空将不再影响的商会，将允许通过加压空气压力增加。除了使用真空泵接近模仿生理条件下，一个直径较大的排气阀可用于生物反应器内的压力迅速下降。目前，3 / 8“直径的排气电磁阀具有流量每分钟3.3加仑（60 °楼比重1），而一个有2个排气阀”的直径有28.0加仑的流量分钟。直径较大的电磁阀是更具成本比使用真空泵有效，但它可能不能够完全为零下降的压力，生理范围内，因此，应进一步调查。另外，几个相同的控制电路触发的电磁阀，同时打开，从而“并行处理”的气体流出。
该系统可以连续运行的内部压缩空气使用。以往的研究表明，在基因和蛋白表达的急性变化可以发生在两个小时16，17 。然而，此期间可能没有足够的机械应力研究瞬时基因/蛋白表达或细胞表型的变化。使用压缩空气的缺点是，气不包含5％的CO 2，控制培养液的pH值是很重要的。这是可以克服的加入HEPES缓冲介质。此外，细胞产生的CO 2作为代谢废物的产品。从组织的CO 2的分泌，还可以防止成为基本的媒介。
此外，测试在不同压力下的主动脉瓣，它可能会审慎研究以及不同频率的影响。例如，心率的变化之前，期间和手术后的效果可以澄清阀门内蛋白表达的变化。术后心律失常发生在高达20％的患者 18-21 。本系统采用LabVIEW程序允许用户选择长的时间空气进入和离开会议厅，因此，周期的频率可以很容易地调整。该设备允许的最大频率为1.5Hz（90bpm）由于排气室的压力所需的时间量。正如在图3中，一个主要的压力减少发生在第一排气阀激活后0.2S可以看出，然后逐渐下降到残压排气其余0.2S。在最初的排气0.2S平均压降为45.8 ± 0.34mmHg，超过20个压力周期测量。由于测试第二阶段高血压条件，只要求至少有60-100毫米汞柱之间循环的压力，一个1.5赫兹的频率允许排气0.22s，这是充足的添e来下降40毫米汞柱的压力。如果真空泵连接到排气阀，它可以促进更快的下降压力，并允许更高的频率测试。然而，生物反应器的最低频率是有限的，因为压力调节器，可以让空气和排气阀缓慢涌入，将有足够的时间反应器内的压力下降。
总之，无菌培养体系已经建成，让猪主动脉心脏瓣膜mechanobiology的体外研究。舒张期跨瓣压差水平之间的生理和病理条件下的生物反应器内的压力循环。为了满足系统要求，的生物反应器结构紧凑，因此，可在培养箱中包含组织的温度保持在37 ° C。此外，压力的幅度和频率的独立控制，允许一个广泛的条件进行研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者感谢他们的设计和制造系统，并与准备的稿子援助Valtresa迈尔斯的协助下沙德Schipke和丹尼尔Chesser。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
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