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Bioengineering

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO 학습

Published: August 23, 2011 doi: 10.3791/3316
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Agricultural and Biological Engineering, Mississippi State University

Summary

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Abstract

좌심실과 대동맥 사이에 대동맥 밸브, 뇌실에 역류 방지, 단방향 혈액의 흐름을 허용합니다. 대동맥 밸브 전단지는 세포외 매트릭스 (ECM) 내에 정지 및 내피 세포 monolayer로 채워져 있습니다 침입형 세포로 구성되어 있습니다. 밸브는 거칠고, 역동적인 환경을 withstands하고 지속적으로 전단, 굴곡, 인장 및 압축에 노출됩니다. 연구 내피 중단하거나 중간 매트릭스 손상 1-3의 결과로 높은 기계적 응력 영역에서 발생하는 질병 밸브에 calcific 병변을 보이지 않고있다. 따라서, 그것은 역학 연구 대동맥 밸브 질환 4 발병의 주요 위험 요인으로 고혈압을 보여준 것은 놀라운 일이 아니다.

밸브 질환에 대해 현재 사용할 수있는 유일한 치료 방법은 bioprosthetic 또는 기계적 밸브 5 낡고 밸브의 수술 대신합니다. 물리적 스트레스에 대한 응답으로 밸브 생물학의 개선 이해 밸브 pathogenesis의 메커니즘을 명료하게하다 도움이 될 것이다. 차례로,이 같은 제약 개입이나 방지와 같은 비침습 요법의 개발에 도움을 줄 수 있습니다. 여러 bioreactors는 이전에 다음 ID로 기본 설계 또는 심장 밸브 6-9의 mechanobiology을 연구하기 위해 개발되었습니다. 타악기 bioreactors 또한 연골 10 골 11 방광을 포함하여 12 조직의 범위를 연구하기 위해 개발되었습니다. 이 작품의 목적은 증가 압력 하중에 대동맥 밸브 전단지의 생물 학적 반응을 명료하게하다하는 데 사용할 수있는 순환 압력 시스템을 개발하는 것이었습니다.

이 시스템은 샘플을 장소와 순환 압력, 압력 사이클의 타이밍을 제어하는​​ viton의 격막 솔레노이드 밸브, 전기 장치를 제어하는​​ 컴퓨터를 생산하는 아크릴 챔버로 구성되어. 압력은 압력 변환기를 사용하여 모니터링할 있었고, 신호는 부하 셀 컨디셔너를 사용하는 시설되었다. LabVIEW 프로그램은 적절한 속도로 시스템에 압축 공기를 펌프하는 아날로그 장치를 사용하여 압력을 규제. 시스템은 대동맥 밸브와 연결된 동적 transvalvular 압력 수준을 했었, 소우 치아 파의 밸브 개방을 묘사한 날카로운 압력 강하 다음 음절 연장 기간 동안 밸브에 걸쳐 존재하는 transvalvular 압력 구배의 전형적인 압력의 점진적 증가, 생산 수축기. LabVIEW 프로그램은 사용자가 주기적 압력의 크기와 주파수를 제어할 수있었습니다. 시스템은 생리와 병리 학적 압력 조건에 조직 샘플을 대상 수있었습니다. 이 장치는 심장 밸브가 로컬 기계 환경의 변화에​​ 대응하는 우리의 이해를 높이기 위해 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 조직 하베스트 및 준비

  1. 대동맥 밸브는 바로 죽은 후 더 이상 120 이상 파운드 무게 성인 돼지에서 수집해야합니다.
  2. 멸균 인산과 함께 두 번 밸브를 세척 식염수 (PBS)와 얼음에 실험실로 전송이 버퍼.
  3. 모든 후속 단계는 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
  4. 그 전단지가 찢어이나 석회화, 변성의 기호를 표시하지 않도록. 환대에서 거리의 1 / 3 절단하여 대동맥 루트에서 전단지를 제거합니다.
  5. 플레이스 여섯 잘 접시의 각각의 우물에서 전단지 37 ° C와 5 % CO 2에서 1퍼센트 anti-biotic/anti-mycotic 솔루션와 10 % 태아 소 혈청과 보충 3ml Dulbecco의 수정된 이글 매체와 함께 밤새 품어.
  6. 대체 절연 세포 6 - 잘 문화 접시에 씨앗을 품고 및 압력 장치에 사용될 수 있듯이. 이전 13 14 설명된대로 밸브 내피 세포와 중간 세포의 분리는 수행할 수 있습니다.

2. 압력 연구

  1. 맞춤 만든 압력 시스템은 대동맥 밸브 조직 15 순환 압력 mechanobiological 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다.
  2. 컴퓨터에 로그인하고 labVIEW 프로그램 (그림 1)을 엽니다.
  3. 보정 :
    1. 이전 실험하기 위해 시스템이 적절히 보정해야합니다.
    2. 회로 기판에 전원 공급 장치를 연결합니다. 이것은 챔버로 밖의 공기의 흐름을 제어 솔레노이드 밸브에 전원을 제공합니다.
    3. 압축 공기가 시스템에 연결되어 있는지 확인하고 전체 속도로 공기 공급 장치를 엽니다.
    4. 신호 증폭기를 켭니다. 전압 독서가 0.00 있는지 확인하십시오. 필요에 따라 조정
    5. labVIEW 인터페이스는 "TEST / 기록"라고 표시된 스위치가 있습니다. 스위치가 "TEST"로 설정되어 있는지 확인하십시오. "공기 공급"유입 솔레노이드 밸브를 열고 표시된 버튼을 클릭합니다.
    6. 가스 압력 조절기를 사용하여, 1 PSI에 압축 공기 챔버의 기압. 챔버의 압력 챔버의 최종 플레이트 후면에있는 디지털 압력 게이지를 사용하여 읽을 수 있습니다. 압력 equilibrated되면, 신호 증폭기에서 전압 독서를 기록합니다. 2, 3, 4 및 5 PSI에 대해 반복합니다.
    7. 압력 대 전압의 보정 곡선을 구축. 압력은 PSI에서 mmHg로 변환해야합니다. 그래프의 방정식은 labVIEW 프로그램의 코드에 삽입할 수 있습니다
  4. 압력 챔버에서 알루미늄 전면 플레이트를 제거하고 70 % 에탄올로 챔버를 스프레이. 잔여 에탄올 가스가 분산 수 있도록 10 분 최소 둡니다.
  5. 챔버에 전단지 샘플을 포함하고있는 여섯 잘 플레이트를 삽입하고 프런트 엔드 플레이트를 교체하십시오. 봉인 손으로 네 개의 스레드 막대 (경판의 각 모서리에 위치)에있는 너트를 강화하여 밀폐 있는지 확인하십시오. 37 ° C 배양기에서 압력 챔버를 놓습니다. 압력 챔버의 구조 다이어그램은 그림 2에 표시됩니다.
  6. 인터페이스는 압축 공기 입력 및 출력 사이의 시스템의 순환 시간을 제공하기 위해 사용자에게 프롬프트합니다. 이러한 1Hz의 주파수에서 각각 0.6s와 모방에 0.4s diastolic과 수축기 조건에 설정해야합니다. 사용자는 또한 데이터 파일의 경로를 입력합니다.
  7. labVIEW, 실행을 클릭하고 "레코드"로 "TEST / 레코드가"토글 스위치.
  8. 압력이 labVIEW 인터페이스에 대한 그래프를 사용하여 원하는 수준에 있는지 확인하십시오. 압력은 가스 압력 조절기를 사용하여 조정할 수 있습니다.
  9. 시간의 원하는 기간 동안 프로그램을 실행합니다.
  10. 실험이 완료되면, labVIEW에있는 중지 버튼을 클릭 공기 공급 장치를 끄고 압력 챔버에 배기 밸브를 엽니다.
  11. 챔버에서 프런트 엔드 플레이트를 제거하고 여섯 잘 플레이트가 포함된 샘플을 검색할 수 있습니다. 샘플은 현재 유전자 발현, 단백질 표현, 조직학, 기계적 성질 등의 분석 수

3. 대표 결과 :

압력 시스템은 normotensive 하에서 관찰 최대 transvalvular 압력을 시뮬레이션 할 수있어, 내가 무대 II 신경성 조건을 무대. 단, 압력은 생체내에 본질적으로 제로입니다 수축기 압력 기울기를 모방 수 없습니다. 주파수는 0.6s 0.4s의과 배기 시간의 공기 유입 시간, 1Hz에서 관리하고 있습니다. 시스템에서 얻은 정상 및 높은 압력 조건의 대표 압력 파형은 그림 3에서 볼 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : LabVIEW 인터페이스의 스크린 샷.

그림 2
그림 2 : 압력 챔버의 압력 챔버 A. 사시의 도식 그림, 압력 챔버의 B. 사이드보기;압력 챔버의 C. 톱 볼 수 있습니다.

그림 3
그림 3 : (A) normotensive, (B) 나는 신경성 스테이지, 그리고 (C) 스테이지 II 신경성 조건에서 압력 챔버 내의 압력 시뮬레이션의 그래프.

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Discussion

압력 시스템은 성공적으로 diastolic transvalvular 압력을 대표했다 순환 압력에 대동맥 밸브 전단지를 노출. 압력은 40 mmHg로 감소 그러나, 그것은 수축기 transvalvular 압력을 모방 수 없습니다. Transvalvular 압력은 오름차순 대동맥의 압력과 좌심실 사이의 차이입니다. 심장 확장하는 동안, 밸브가 닫힐 때, 압력 차이가 normotensive 조건 90 mmHg 이하 80mmHg이며 무대 II의 고혈압은 각각 단계 100mmHg. 수축기 동안, 밸브가 열려있을 때, 좌심실과 대동맥 사이에 상승 압력 차이가 제로입니다. 대동맥 밸브 질환에서 발생하는 세포 변화가 높은 diastolic 압력과 연관된 것으로 않으므로 압력이 제로로 떨어진 게 아니라는 사실은 큰 우려되지 않을 수 있습니다. 이것은 그것이 압력 크기 및 생물 학적 반응의 원동력되지 압력 진폭이라는 가정을 기반으로합니다. 100 mmHg에서 0 mmHg로 압력을 감소시 20 압력 사이클의 데이터 분석에서 보고된 1.20 ± 0.04s를 필요로합니다. 대동맥 밸브가 닫혀 시간 금액은 심장주기의 약 삼분의이 있기 때문에, 압력 챔버에 공기의 유입 밸브 개방 같은 균형을 만들고 생리적 조건에 경험 닫기 2.4s해야합니다. 그 결과, 0.28 Hz의 주파수는 수축기 및 대동맥 밸브 mechanobiology에 diastolic transvalvular 압력 수준 모두의 효과를 테스트하기 위해 사용됩니다. 그러나, 수축기 및 diastolic transvalvular 압력 모두 1 Hz에서, 진공 펌프 및 저수지의 생리적 주파수에서 시뮬레이션하는 경우에는 배기 솔레노이드 밸브에 장착되어 수 있습니다. 진공 펌프는 배기 밸브가 열리면 때문에 압력의 고정 금액을 제거하도록 설정되어 수, 완전히 설정된 압력 수준에서 압력을 줄이기 위해 필요한 공기의 금액은 진공 저수지로 발행한 것입니다. 압력의 제거, 수축기 transvalvular 압력과 동의어 0 mmHg 환경을 만드는 것입니다. 반대로, 배기 밸브가 닫혀있을 때에는, 진공 더 이상 챔버에 영향을 미치지 않습니다 그리고 압력이 압력 공기를 통해 증가시킬 수있게합니다. 가까이 생리적 조건을 모방하기 위해 진공 펌프를 사용하는 외에, 큰 직경이 배기 밸브가 더 빨리 생물 반응기 내의 압력을 드롭하는 데 사용할 수 있습니다. 현재 3 / 8 "직경 배기 솔레노이드 밸브는 분당 3.3 갤런의 유량이 (60을 ° 1 F, 비중), 2 배기 밸브, 반면에"직경 당 28.0 갤런의 유량을 잠깐만. 큰 직경의 솔레노이드 밸브는 진공 펌프를 사용하는 것보다 비용이 훨씬 더 효과적이다, 그러나 그것은 생리적 범위 내에서 제로로 완전히 압력을 드롭하지 못할 수 있으며 따라서 더 조사해야합니다. 또는, 동시에 열려 같은 제어 회로에 의해 트리거 여러 솔레노이드 밸브는이를 "병렬 처리"가스 유출을 추가할 수 있습니다.

시스템은 지속적으로 압축 공기 - 집안에 사용하는 운영 수 있습니다. 이전 연구는 유전자 및 단백질 발현의 급성 변화 두 시간 16, 17 시간 발생할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 그러나이 기간은 기계적 스트레스의 결과로 일시적 유전자 / 단백질 표현이나 세포 표현형의 변화를 연구하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 압축 공기를 사용하는 단점은 가스 5 %에게 문화 매체의 산도를 조절 중요 CO 2를 포함하지 않는다는 것입니다. 이것은 매체 hepes 버퍼를 추가하여 해결할 수 있습니다. 또한, 세포 신진 대사 폐기물 제품으로 CO 2를 생성합니다. 조직에서 CO 2의 분비는 또한 기본되는 매체를 방지할 수 있습니다.

다양한 압력의 대동맥 밸브를 테스트 이외에, 그것은뿐만 아니라 주파수를 변화의 효과를 연구하기 위해 신중한 수 있습니다. 예를 들어, 동안 전에 심장 박동의 변화, 그리고 수술 후의 효과는 밸브 내의 단백질 발현의 변화를 명료하게하다 수 있습니다. 수술후 arrhythmias 환자의 18-21 최대 20 %에서 발생합니다. 이 시스템에 사용되는 LabVIEW 프로그램은 사용자가 입력한 시간 공기의 길이를 선택할 수 있으며 챔버 잎, 따라서,주기의 주파수를 쉽게 조정할 수 있습니다. 장치는 챔버의 압력을 배출하는 데 필요한 시간의 양을에 의한 1.5Hz (90bpm)의 최대 주파수를 허용합니다. 그림 3, 배기 밸브 작동 후 첫 0.2s에서 발생한 주요 압력 감소에서 본 다음, 점차적으로 배기 가스의 남은 0.2s에 대한 잔류 압력을 거부했다. 배기 가스의 초기 0.2s의 평균 압력 강하는 45.8되었습니다 ± 20 압력 사이클을 통해 측정 0.34mmHg. 스테이지 II 신경성 조건을 테스트하는 것은에서만 적어도 60-100 mmHg 사이에 자전거 압력을 필요 감안할 때, 1.5 Hz의 주파수가 배기 가스에 대한 0.22s을 허용, 이것은 충분한 팀입니다E는 압력 40 mmHg를 드롭합니다. 진공 펌프는 배기 밸브에 연결되어있다면, 그것은 압력에 신속하게 드롭을 용이하게 수 있으며, 높은 주파수 테스트를 허용합니다. 압력 조절기는 공기와 배기 밸브의 느린 유입은 원자로 내의 압력을 드롭하는 충분한 시간을했을 수 있기 때문에 생물 반응기의 최소 주파수는, 그러나 이에 국한되지 않습니다.

결론적으로, 살균 문화 시스템은 돼지의 심장의 대동맥 밸브 mechanobiology의 전 생체내 연구를 허용하도록 구축되었습니다. 생물 반응기 내의 압력은 생리와 병리 학적 조건 diastolic transvalvular 압력 수준 사이 순환될. 시스템 요구 사항을 충족시키려면, 생물 반응기는 37 조직의 온도를 유지하기 위해 압축되었으며 따라서 humidified 인큐베이터 내에 포함된 수 있습니다 ° C. 또한, 압력 크기와 주파수는 조건의 광범위한 연구가 될 수 있도록 독립적으로 제어되었다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 원고를 준비하여 시스템 및 지원 Valtresa의 마일즈의 설계 및 제조와 그들의 도움을 쉐그 Schipke, 다니엘 체서에게 감사하고 있습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D5671
Dulbecco’s PBS Sigma-Aldrich D5652
Anti-mycotic/antibiotic solution Sigma-Aldrich A5955
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific, Inc. SH30070
Viton diaphragm solenoid valves McMaster-Carr 4868K11
Pressure Transducer Omega Engineering, Inc. PX302-200GV
Load cell conditioner Encore Electronics, Inc. 4025-101
Data Acquisition (DAQ) Module Measurement Computing PMD1608

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References

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