Summary
Basınç koşulları fizyolojik ve patolojik kalp kapakçığı dokusu tabi yapabilen bir siklik basınç biyoreaktör dizayn edilmiştir. LabVIEW programı, kullanıcıların basınç büyüklüğü, genlik ve frekans kontrol etmenizi sağlar. Bu cihaz, kalp kapakçığı dokusu veya izole hücrelerin mechanobiology incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Ventrikül içine geri akmasını önlemek, sol ventrikül ve aorta arasında bulunan aort kapak, tek yönlü kan akımını sağlar. Aort kapak broşürler, interstisyel hücreleri ve endotel hücre tek tabaka ile kaplı, bir ekstrasellüler matriks (ECM) içinde askıya oluşur. Vana sert, dinamik bir ortamda dayanıklıdır ve kesme, fleksiyon, gerginlik, ve sıkıştırma sürekli maruz kalmaktadır. Araştırma endotel bozulması veya interstisyel matris hasar 1-3 bir sonucu olarak, yüksek mekanik stres alanlarında meydana hastalıklı vanalar kalsifik lezyonlar göstermiştir . Bu nedenle, epidemiyolojik çalışmalarda yüksek kan basıncı, aort kapak hastalığı 4 başlangıcı önde gelen risk faktörü olarak göstermiştir ki şaşırtıcı değildir .
Hastalıklı bir biyoprotez ve mekanik kapak 5 ile vana, kapak hastalığı için mevcut tek tedavi seçeneği cerrahi yerine geçer . Fiziksel strese yanıt olarak vana biyolojisinin daha iyi anlaşılması, valf patogenezinin mekanizmaları aydınlatmak yardımcı olacaktır. Buna karşılık, bu gibi ilaç müdahale ya da önlenmesi gibi non-invaziv tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Çeşitli biyoreaktörler daha önce, yerli veya mühendislik kalp kapakçıkları 6-9 mechanobiology okumak için geliştirilmiştir . Pulsatil biyoreaktörler da dahil olmak üzere dokularda kıkırdak 10, 11 kemik ve mesane 12 bir dizi çalışma için geliştirilmiştir. Bu çalışmanın amacı, yüksek basınç yükleri aort kapak broşür biyolojik yanıt aydınlatmak için kullanılan olabilir döngüsel bir basınç sistemi geliştirmek için oldu.
Sistem örnekleri yer ve döngüsel basınç, basınç döngüsünün zamanlamasını kontrol etmek için viton diyafram solenoid valfler, ve elektrikli cihazları kontrol etmek için bir bilgisayar üretmek için akrilik bir odasının oluşuyordu. Basınç, basınç dönüştürücü kullanarak takip edildi ve sinyal bir yük hücresi kremi kullanılarak klimalı. LabVIEW programı uygun hızda sistem içine basınçlı hava pompalamak için bir analog cihaz kullanarak basınç düzenlenmiştir. Sistem, aort kapak ile ilişkili dinamik transvalvüler basınç seviyeleri taklit bir testere dişi dalga kapak açılışını temsil eden keskin bir basınç düşüşü takip diyastolde vana üzerinden mevcut olduğunu transvalvüler basınç gradiyenti tipik basınç kademeli bir artış, üretilen sistol. LabVIEW programı kullanıcıları siklik basınç büyüklüğü ve sıklığı kontrol etmek için izin verdi. Sistem basınç koşulları fizyolojik ve patolojik doku örnekleri konu başardı. Bu cihaz, kalp kapakçıkları, yerel mekanik çevre değişiklikleri nasıl cevap anlayışımızı artırmak için kullanılabilir.
Protocol
1. Doku Hasat ve Hazırlık
- Aort vanaları hemen ölümünden sonra en fazla 120 kg ağırlığında yetişkin domuz toplanan olmalıdır.
- Valfler iki kez yıkayın steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve buz üzerinde laboratuar ulaşım.
- Tüm sonraki basamaklar steril şartlar altında yapılmalıdır.
- Bu broşür, yırtılma ya da kireçlenme dejenerasyon herhangi bir işaret yok olun. Aort kökü broşürler annulus mesafenin 1 / 3 keserek çıkarın.
- Yeri altı plaka bireysel kuyularda broşürler ve bir gecede 37 ° C ve% 5 CO 2% 1 anti-biotic/anti-mycotic çözüm ve% 10 fetal sığır serumu ile takviye 3ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta kuluçkaya yatmaktadır.
- Alternatif, izole hücreler altı kuyu kültür plakaları numaralı seribaşı ve basınçlı cihaz gibi. Daha önce açıklandığı gibi 13, 14 valf endotel hücreleri ve interstisyel hücre izolasyonu yapılabilir.
2. Basınç Çalışmaları
- Aort kapak dokusu 15 siklik basınç mechanobiological etkilerini incelemek amacıyla yapılmış özel bir basınç sistemi dizayn edilmiştir.
- Bilgisayara oturum açın ve LabVIEW programı açın (Şekil 1).
- Kalibrasyon:
- Öncesinde deney, sistemin düzgün kalibre edilmelidir.
- Güç kaynağı devre kartına bağlayın. Bu odasına ve dışarı hava akışını kontrol solenoid valfler için güç sağlar.
- Basınçlı hava sistemine bağlı olduğundan emin olun ve tam hızı ile hava beslemesi açık.
- Sinyal amplifikatörü açın. Voltaj okuma 0.00 olduğundan emin olun. Gerektiği gibi ayarlayın.
- LabVIEW arayüzü "TEST / RECORD" işaretli bir anahtarı vardır. Anahtarı "TEST" olarak ayarlanmış olduğundan emin olun. "Hava İkmal giriş selenoid vana açmak için" işaretli düğmeye tıklayın.
- Gaz basınç regülatörü kullanarak, sıkıştırılmış hava ile odasına 1 PSI basınç. Odasında basınç odasının arka uç plakası bulunan dijital basınç göstergesi kullanılarak okunabilir. Basıncı dengelenir sonra, sinyal kuvvetlendirici voltaj okuma kaydedin. 2, 3, 4 ve 5 PSI tekrarlayın.
- Basınç vs gerilim bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Basınç PSI mmHg dönüştürülmesi gerekir. LabVIEW programı kod grafikte denklemi içine yerleştirilebilir
- Alüminyum ön plaka basınç odasından çıkarın ve% 70 etanol ile odanın sprey. Kalan etanol dumanı dağıtmak için izin vermek için en az 10 dakika bekletin.
- Odasına broşür örnekleri içeren altı plaka yerleştirin ve ön uç plakasını değiştirmek. Mühür, el ile uç plakası her köşesinde bulunan dört dişli çubuklar bulunan somunları sıkarak hava geçirmez olduğundan emin olun. 37 ° C inkübatör, basınç odasının yerleştirin. Basınç odasının şematik diyagramı Şekil 2'de gösterilmiştir.
- Kullanıcı arayüzü, basınçlı hava giriş ve çıkış arasındaki sistemi döngüleri zaman miktarını sağlamak için isteyecektir. Bu 1Hz bir sıklık sırasıyla, 0.6s ve taklit etmek 0.4s diyastolik ve sistolik koşulları, ayarlanmış olmalıdır. Kullanıcı ayrıca bir veri dosyası yolu girmeniz gerekir.
- LabVIEW'da çalıştırmak tıklayın ve "TEST / RECORD" "KAYIT" geçiş anahtarı.
- Basınç LabVIEW arayüzü grafik kullanarak istenilen düzeyde olduğundan emin olun. Basınçlı gaz basınç regülatörü kullanarak ayarlanabilir.
- Zaman istenilen uzunlukta için programı çalıştırın.
- Deney tamamlandıktan sonra, LabVIEW üzerinde stop düğmesini tıklatın, hava kaynağı kapatmak ve basınç odasının egzoz valfi açık.
- Ön uç plakası odasından çıkarın ve altı plaka içeren numuneler almak. Örnekleri gen ekspresyonu, protein ekspresyonu, histoloji, mekanik özellikleri vb analiz edilebilir
3. Temsilcisi Sonuçlar:
Basınç sistemi normotansif altında gözlenen maksimum transvalvüler baskılara taklit yeteneğine sahip, I ve evre II hipertansif koşulları sahne. Ancak, basınç, in vivo olarak aslında sıfır sistolik basınç gradyan, taklit etmek mümkün değildi. Frekans 0.6s ve 0.4s bir egzoz kez bir hava giriş zamanı, 1Hz korunur. Sistemden elde edilen normal ya da yüksek basınç koşulları Temsilcisi basınç dalga şekilleri Şekil 3'te görülebilir.
Şekil 1: LabVIEW arayüzünün ekran görüntüsü.
Şekil 2: Şematik çizim basınç odasının, basınç odasının A. İzometrik görünüm; basınç odasının B. Yandan görünüm;C. basınç odasının görünümü.
Şekil 3: (A) normotansif, (B) hipertansif Sahne, ve (C) Evre II hipertansif koşulları, basınç odasının içinde basınç simülasyon grafiği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Basınç sistemi başarıyla aort kapak broşürler, diastolik transvalvüler basınç temsilcisi siklik baskılara maruz. Ancak, sadece basıncı 40 mmHg düştü, sistolik transvalvüler basınç taklit etmek mümkün değildi. Transvalvüler basınç Asendan aorta ve sol ventrikül basıncı arasındaki farktır. Diyastol sırasında, kapak kapatıldığında, normotansif koşulları ve 90 mmHg altında basınç farkı 80mmHg ve evre I ve evre II hipertansiyon, sırasıyla 100mmHg. Sistol sırasında, kapak açık olduğu zaman, sol ventrikül ve asendan aort arasındaki basınç farkı sıfır olur. Aort kapak hastalığı ortaya çıkan hücresel değişiklikler, yüksek diastolik basınç ile ilişkili olduğu düşünülmektedir, bu nedenle basıncı sıfıra düşmedi aslında büyük bir endişe olmayabilir. Bu basınç büyüklüğü ve biyolojik tepkiler arkasındaki itici güç değildir basınç genliği olduğu varsayımına dayanmaktadır. 0 100 mmHg mmHg basıncı azaltmak, 20 basınç çevriminde veri analizi bildirilen 1.20 ± 0.04s, gerektirir. Aort kapak kapalı süreyi kalp döngüsü yaklaşık 2 / 3 olduğundan, basınç odasına hava akını vana açma aynı denge oluşturmak ve fizyolojik koşullarda deneyimli kapanış 2.4s gerektirecektir. Sonuç olarak, 0,28 Hz frekans sistolik ve diyastolik aort kapak mechanobiology transvalvüler basınç seviyeleri hem de etkileri test etmek için kullanılacaktır. Ancak, sistolik ve diyastolik transvalvüler basınç hem de fizyolojik bir frekansı 1 Hz, bir vakum pompası ve rezervuar simüle edilmesi için egzoz solenoid valf takılmış olabilir. Vakum pompası, egzoz valfi açıldığında sabit bir basınç miktarı kaldırmak için ayarlanmış olabilir, tamamen set basıncı seviyesi basıncı azaltmak için gerekli hava miktarı vakum rezervuar içine çizilmiş olur. Kaldırma basıncı, sistolik transvalvüler basınç ile eşanlamlı 0 mmHg ortamı yaratacaktır. Tersine, egzoz valf kapandığında, vakum odasının artık etkileyecek ve basınçlı hava ile basınç artışı sağlayacak. Fizyolojik şartlar yakın olarak taklit etmek için bir vakum pompası kullanmanın yanı sıra, daha büyük bir çapa sahip bir egzoz valf, daha hızlı biyoreaktör içindeki basıncı düşmesi kullanılabilir. Şu anda, 3 / 8 "çap egzoz solenoid valf akış hızı dakikada 3.3 litre (60 ° F 1, özgül ağırlık); 2 ile egzoz vanası, oysa" çap ortalama 28.0 litre debisi dakika. Büyük çaplı bir solenoid valf, bir vakum pompası kullanarak daha etkili daha düşük maliyetli, ancak fizyolojik aralığında tamamen sıfır basınç düşmesi mümkün olmayabilir ve bu nedenle daha da araştırılması gerekir. Alternatif olarak, aynı anda açtığınız aynı kontrol devresi tarafından tetiklenen çeşitli solenoid valfler, böylece "paralel işleme" gaz çıkışı olabilir.
Sistemi sürekli olarak basınçlı hava-house kullanılarak ameliyat olabilir. Önceki çalışmalar, gen ve protein ekspresyonu akut değişiklikler iki saat 16, 17 içinde meydana gelebileceğini göstermiştir . Ancak, mekanik stresin bir sonucu olarak geçici bir gen / protein ekspresyonu veya hücresel fenotip değişiklikleri incelemek için bu süre yeterli olmayabilir. Dezavantajı basınçlı hava kullanarak, gaz,% 5 CO 2, kültür ortamın pH kontrolü için önemlidir içermediğinden emin. Bu orta HEPES tamponu ekleyerek üstesinden gelinebilir. Ayrıca, hücrelerin metabolik atık ürün olarak CO 2 üretir. Salgı doku CO 2 de orta olma temel engel olacaktır.
Değişik basınçlarda aort kapakları test ek olarak, yanı sıra frekansları değişen etkilerini incelemek için ihtiyatlı olabilir. Örneğin, sırasında ve sonrasındaki kalp hızı değişiklikleri, ve ameliyat sonrası etkileri vana içinde protein ekspresyonu değişiklikleri açıklığa kavuşturduk. Postoperatif aritmiler, hastaların% 20 'e kadar 18-21 oluşur . Bu sistem için kullanılan LabVIEW programı kullanıcının girdiği zaman hava süresini seçmenize olanak verir ve oda bırakır, bu nedenle döngüsü frekansı kolayca ayarlanabilir. Cihaz odasından basıncı boşaltmak için gerekli zaman miktarı nedeniyle 1.5Hz (90bpm) maksimum frekans için izin verir. Şekil 3, egzoz vanası aktivasyon sonra ilk 0.2s meydana gelen büyük bir basınç azalma görüldüğü gibi, sonra yavaş yavaş egzoz kalan 0.2s basınçın yapmaktan kaçındı. Egzoz ilk 0.2s ortalama basınç düşüşü 45.8 ± 20 basınç çevrimi boyunca ölçülen 0.34mmHg. Evre II hipertansif koşulları, yalnızca test en az 60-100 mmHg arasında bisiklet basıncı gerektirdiği göz önüne alındığında, 1.5 Hz frekans egzoz 0.22s verir, bol time basıncı 40 mmHg düşmesi. Bir vakum pompası, egzoz subabı bağlıysa, daha hızlı bir düşüş basınç kolaylaştırmak ve yüksek frekans test izin verecek. Biyoreaktör minimum frekans, basınç regülatörü, hava ve egzoz vanası yavaş akını reaktör içindeki basıncı düşmesi için yeterli zaman olurdu izin çünkü, ancak, sınırlı değildir.
Sonuç olarak, steril bir kültür sistemi domuz aort kalp kapakçığı mechanobiology, ex vivo çalışma izin vermek için inşa edilmiştir. Biyoreaktör içindeki basınç, diastolik transvalvüler basınç seviyeleri arasındaki fizyolojik ve patolojik koşullar sağlanıncaya. Biyoreaktör, sistem gereksinimlerini karşılamak için, 37 doku sıcaklığını korumak için kompakt ve bu nedenle nemlendirilmiş bir kuvöz içinde bulunan olabilir ° C Ayrıca, basınç büyüklüğü ve sıklığı, koşulları geniş bir yelpazede ele alınmalıdır sağlayan bağımsız kontrol altına alındı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar, sistem ve yazının hazırlanmasında yardım için Valtresa Myles tasarım ve üretim ile yardım için Shad Schipke ve Daniel Chesser minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
