Summary
Un biorreactor presión cíclica capaz de someter a los tejidos del corazón de la válvula de presión a las condiciones fisiológicas y patológicas ha sido diseñado. Un programa LabVIEW permite a los usuarios para controlar la presión magnitud, amplitud y frecuencia. Este dispositivo puede ser utilizado para estudiar el tejido mecanobiología de las válvulas del corazón o células aisladas.
Abstract
La válvula aórtica, localizada entre el ventrículo izquierdo y la aorta, permite un flujo unidireccional de sangre, evitando el reflujo hacia el ventrículo. Folletos de la válvula aórtica se componen de células intersticiales suspendido dentro de una matriz extracelular (MEC) y se alinean con una monocapa de células endoteliales. La válvula resistente a un ambiente duro, dinámico y está constantemente expuesto a corte, flexión, tensión y compresión. Las investigaciones han demostrado lesiones calcificadas en las válvulas enfermas se producen en zonas de alto esfuerzo mecánico como consecuencia de la alteración del endotelio o daño de la matriz intersticial 1-3. Por lo tanto, no es de extrañar que los estudios epidemiológicos han demostrado que la hipertensión es un factor de riesgo en la aparición de la enfermedad de la válvula aórtica 4.
La única opción de tratamiento actualmente disponibles para la enfermedad de la válvula es la cirugía de reemplazo de la válvula enferma por una válvula mecánica o bioprótesis 5. Una mejor comprensión de la biología de la válvula en respuesta a las tensiones físicas que ayudan a dilucidar los mecanismos de la patogénesis de la válvula. A su vez, esto podría ayudar en el desarrollo de terapias no invasivas, como la intervención farmacéutica o la prevención. Biorreactores varios han sido previamente desarrollado para estudiar la mecanobiología de las válvulas del corazón nativo o ingeniería 6-9. Biorreactores pulsátil también se han desarrollado para estudiar una amplia gama de tejidos incluyendo el cartílago 10, 11 huesos y la vejiga 12. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema de presión cíclica que puede ser utilizado para dilucidar la respuesta biológica de la válvula aórtica a las cargas de mayor presión.
El sistema consistía en una cámara de acrílico en el que colocar las muestras y producir una presión cíclica, viton válvulas de solenoide del diafragma para controlar el tiempo del ciclo de presión, y un ordenador para controlar los dispositivos eléctricos. La presión se controlará mediante un transductor de presión, y la señal se acondicionó con un acondicionador de la célula de carga. Un programa LabVIEW regula la presión usando un dispositivo analógico a la bomba de aire comprimido en el sistema a la velocidad adecuada. El sistema imita la dinámica de los niveles de presión transvalvular asociados con la válvula aórtica, una onda de diente de sierra produce un aumento gradual en la presión, típico de la gradiente de presión transvalvular que está presente a través de la válvula durante la diástole, seguida de una fuerte caída de presión que representa la apertura de la válvula en sístole. El programa LabVIEW permite a los usuarios controlar la magnitud y la frecuencia de presión cíclica. El sistema fue capaz de someter a las muestras de tejido de las condiciones de presión fisiológicos y patológicos. Este dispositivo se puede utilizar para aumentar nuestra comprensión de cómo las válvulas del corazón responder a los cambios en el entorno mecánico local.
Protocol
1. Tejido de cosecha y preparación
- Válvulas aórtica deben ser tomadas de cerdos adultos que no pesen más de 120 libras inmediatamente después de la muerte.
- Lave las válvulas de dos veces con solución salina estéril tamponada de fosfato (PBS) y el transporte al laboratorio en hielo.
- Todos los pasos posteriores se deben realizar bajo condiciones estériles.
- Asegúrese de que los folletos no muestran ningún signo de degeneración, lagrimeo o calcificación. Quitar folletos de la raíz aórtica mediante la reducción de 1 / 3 de la distancia desde el anillo.
- Folletos a cabo en los distintos pozos de una placa de seis pocillo e incubar durante la noche con 3 ml de Dulbecco modificado medio de Eagle suplementado con 1% de solución anti-biotic/anti-mycotic y el 10% de suero fetal bovino a 37 ° C y 5% CO 2.
- Como una alternativa de células, aisladas pueden ser sembradas en placas de cultivo de seis pozos y se utiliza en el dispositivo de presión. Válvula de aislamiento de las células endoteliales y células intersticiales puede llevar a cabo como se describió previamente 13, 14.
2. Estudios de presión
- Un sistema de presión a medida ha sido diseñado para estudiar los efectos de la presión mechanobiological cíclico en el tejido de la válvula aórtica 15.
- Inicie sesión en el ordenador y abrir el programa LabVIEW (Figura 1).
- Calibración:
- Antes de la experimentación, el sistema debe estar bien calibrados.
- Conecte la fuente de alimentación a la placa de circuito. Esto proporciona energía a las válvulas solenoides que controlan el flujo de aire dentro y fuera de la cámara.
- Asegúrese de que el aire comprimido está conectado al sistema y abrir el suministro de aire a velocidad plena.
- Encienda el amplificador de señal. Asegúrese de que la lectura de voltaje es de 0,00. Realice los ajustes necesarios
- La interfaz de LabVIEW tiene un interruptor marcado "TEST / RECORD". Asegúrese de que el interruptor está en "TEST". Haga clic en el botón "Air Supply" para abrir la válvula solenoide de entrada.
- Usando el regulador de presión de gas, presurizar la cámara con aire comprimido a un ISP. La presión en la cámara se pueden leer con el medidor de presión digital en la parte posterior de la placa terminal de la cámara. Una vez que la presión se equilibra, se registra la lectura de voltaje del amplificador de la señal. Repita el procedimiento para la ISP 2, 3, 4 y 5.
- Construir una curva de calibración de presión función de la tensión. La presión debe ser convertida de PSI para mmHg. La ecuación de la gráfica se puede colocar en el código del programa LabVIEW
- Retire la placa frontal de aluminio de la cámara de presión y rocíe la cámara con un 70% de etanol. Deja por un mínimo de 10 minutos para permitir que los gases residuales de etanol a disiparse.
- Coloque la placa de seis pozos que contienen las muestras de hoja en la cámara y vuelva a colocar la placa frontal. Asegúrese de que el sello hermético de apretar las tuercas ubicadas en las cuatro varillas roscadas (que se encuentra en cada esquina de la placa final) con la mano. Coloque la cámara de presión en la incubadora a 37 ° C. Un diagrama esquemático de la cámara de presión se muestra en la figura 2.
- La interfaz le pedirá al usuario que proporcione la cantidad de tiempo entre los ciclos del sistema entrada de aire comprimido y de salida. Estos deben ser reguladas para las condiciones diastólica y sistólica y 0,6 s 0,4 s para imitar, respectivamente, a una frecuencia de 1Hz. El usuario debe entrar en una ruta de archivo de datos.
- En LabVIEW, haga clic en Ejecutar y el interruptor "TEST / RECORD" cambiar a "RECORD".
- Asegúrese de que la presión está en el nivel deseado con el gráfico de la interfaz de LabVIEW. La presión se puede ajustar con el regulador de presión de gas.
- Ejecute el programa de tiempo deseado.
- Una vez que el experimento se haya completado, haga clic en el botón de parada en LabVIEW, a su vez el suministro de aire y abra la válvula de escape en la cámara de presión.
- Retire la placa frontal de la cámara y recuperar muestras de seis pozos placa que contiene. Muestras que ahora se puede analizar la expresión de genes, expresión de la proteína, la histología, propiedades mecánicas, etc
3. Los resultados representativos:
El sistema de presión es capaz de simular las presiones máximas transvalvular observado en normotensos, la etapa I y II etapa de las condiciones de hipertensos. Sin embargo, la presión no era capaz de imitar el gradiente de presión sistólica, que es esencialmente cero en vivo. La frecuencia se mantiene a 1 Hz, con un tiempo de entrada de aire de 0,6 s y un tiempo de 0,4 s de escape. Formas de onda representante presión de las condiciones normales de presión y elevados obtenidos del sistema se puede ver en la figura 3.
Figura 1: Captura de pantalla de la interfaz de LabVIEW.
Figura 2: Esquema de la cámara de vista de la presión A. isométrica de la cámara de presión, ver B. secundarios de la cámara de presión;C. Vista superior de la cámara de presión.
Figura 3: Gráfico de simulación de la presión dentro de la cámara de presión en (A) normotensos, (B) Fase I hipertensos, y (C) Fase II las condiciones de hipertensos.
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Discussion
El sistema de presión con éxito la válvula aórtica folletos expuestos a las presiones cíclicas que eran representativos de la presión diastólica transvalvular. Sin embargo, no fue capaz de imitar la presión sistólica transvalvular, como la única presión se redujo a 40 mmHg. Presión transvalvular es la diferencia entre la presión en la aorta ascendente y el ventrículo izquierdo. Durante la diástole, cuando la válvula está cerrada, la diferencia de presión es 80 mmHg en condiciones normotensos y 90 mmHg y 100 mmHg en la etapa I y etapa II hipertensión, respectivamente. Durante la sístole, cuando la válvula está abierta, la diferencia de presión entre el ventrículo izquierdo y la aorta ascendente es igual a cero. Los cambios celulares que ocurren en la enfermedad de la válvula aórtica se cree que están asociados con la presión diastólica alta, por lo tanto, el hecho de que la presión no cayó a cero no puede ser una preocupación importante. Esto se basa en la suposición de que es la magnitud de presión y amplitud de la presión que no es la fuerza impulsora detrás de las respuestas biológicas. La reducción de la presión de 100 mmHg a 0 mmHg requiere 1,20 ± 0.04s, informó del análisis de datos de 20 ciclos de presión. Dado que la cantidad de tiempo se cierra la válvula aórtica es aproximadamente 2 / 3 del ciclo cardíaco, el flujo de aire en la cámara de presión que requieren 2.4s para crear el mismo balance de apertura de la válvula y el cierre de experiencia en condiciones fisiológicas. Como resultado, una frecuencia de 0,28 Hz se utiliza para probar los efectos de la presión sistólica y diastólica, niveles de presión transvalvular en mecanobiología de la válvula aórtica. Sin embargo, si la presión sistólica y diastólica transvalvular se simula a una frecuencia fisiológica de 1 Hz, una bomba de vacío y el depósito puede ser instalado en la válvula de solenoide de escape. La bomba de vacío puede establecer para eliminar una cantidad fija de presión por lo que cuando se abre la válvula de escape, la cantidad de aire necesaria para reducir por completo la presión desde el nivel de presión de ajuste se elaborará en el depósito vacío. La eliminación de la presión que crean un ambiente mmHg 0, sinónimo de presión transvalvular sistólico. Por el contrario, cuando la válvula de escape se cierra, el vacío ya no afectará a la cámara que permita a la presión para aumentar a través de aire comprimido. Además de utilizar una bomba de vacío para imitar las condiciones fisiológicas más cerca, una válvula de escape de mayor diámetro se puede utilizar para bajar la presión en el reactor biológico con mayor rapidez. En la actualidad, el 3 / 8 "de diámetro de escape de la válvula solenoide tiene un caudal de 3,3 galones por minuto (a 60 ° F, la gravedad específica de 1), mientras que una válvula de escape con 2" de diámetro con un caudal de 28,0 litros por minutos. Una válvula de solenoide de diámetro más grande es más rentable que el uso de una bomba de vacío, sin embargo puede que no sea capaz de bajar la presión completamente a cero dentro del rango fisiológico y por lo tanto se debe investigar más. Por otra parte, varias válvulas de solenoide provocada por el mismo circuito de control que se abren al mismo tiempo se podría añadir, por lo que "de procesamiento en paralelo" la salida de gas.
El sistema podría funcionar de forma continua utilizando en la casa de aire comprimido. Estudios previos han demostrado que los cambios agudos en la expresión génica y proteica puede ocurrir dentro de dos horas 16, 17. Sin embargo, esta duración puede no ser suficiente para estudiar transitoria de genes / proteínas de expresión o cambios en el fenotipo celular, como resultado de la tensión mecánica. La desventaja de usar el aire comprimido es que el gas no contiene 5% de CO 2, lo cual es importante para controlar el pH del medio de cultivo. Esto se puede superar mediante la adición de tampón HEPES en el medio. Además, las células producen CO 2 como producto de desecho del metabolismo. La secreción de CO 2 de los tejidos también evitará que el medio de convertirse en fundamental.
Además de las pruebas de válvulas aórticas a diferentes presiones, puede ser prudente para estudiar los efectos de diferentes frecuencias. Por ejemplo, los efectos de los cambios en la frecuencia cardiaca antes, durante y después de la cirugía podría aclarar los cambios en la expresión de la proteína dentro de la válvula. Arritmias postoperatorias ocurren hasta en un 20% de los pacientes 18-21. El programa LabVIEW utilizado para este sistema permite al usuario elegir la duración de tiempo de aire que entra y sale de la cámara, por lo tanto, la frecuencia del ciclo se puede ajustar fácilmente. El dispositivo permite una frecuencia máxima de 1.5Hz (90bpm) debido a la cantidad de tiempo necesario para agotar la presión de la cámara. Como se ve en la figura 3, una disminución de presión importante se produjo en la primera 0.2s después de la activación de la válvula de escape, y luego disminuyó gradualmente a la presión residual de 0,2 segundos restantes de gases de escape. La caída de presión media en el 0,2 s iniciales de escape fue de 45,8 ± 0.34mmHg, mide más de 20 ciclos de presión. Dado que las pruebas de Fase II las condiciones de hipertensos sólo se requiere una presión de ciclismo por lo menos entre 60 a 100 mmHg, una frecuencia de 1,5 Hz permite 0.22s de escape, que es amplio time de caída de 40 mmHg de presión. Si una bomba de vacío está conectada a la válvula de escape, podría facilitar un rápido descenso en la presión y que permiten una mayor frecuencia de las pruebas. La frecuencia mínima del biorreactor no se limita, sin embargo, debido a que el regulador de presión podría permitir flujo lento de aire y la válvula de escape tendría tiempo suficiente para bajar la presión dentro del reactor.
En conclusión, un sistema de cultivo estéril se ha construido para permitir el estudio ex vivo de la válvula aórtica porcina mecanobiología corazón. La presión en el biorreactor un ciclo entre los niveles de presión diastólica transvalvular de las condiciones fisiológicas y patológicas. Para cumplir con los requisitos del sistema, el biorreactor fue compacto y por lo tanto, podría estar contenido dentro de un incubador humidificado para mantener la temperatura de los tejidos a 37 ° C. Además, la magnitud de presión y frecuencia fueron controlados de forma independiente, lo que permite una amplia gama de condiciones de estudio.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Shad y Schipke Chesser Daniel por su ayuda con el diseño y fabricación del sistema y Myles Valtresa de asistencia con la preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
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