Summary
Bioreactor לחץ מחזורית מסוגל להעמיד שסתום רקמת לב לתנאי הלחץ פיזיולוגיים ופתולוגיים תוכנן. תוכנית LabVIEW מאפשר למשתמשים לשלוט על גודל הלחץ, משרעת ותדירות. מכשיר זה יכול לשמש כדי לחקור את mechanobiology של רקמת לב שסתום או תאים בודדים.
Abstract
שסתום אבי העורקים, הנמצא בין החדר השמאלי לבין אבי העורקים, שמאפשר זרימת דם חד כיווני, מונע backflow לתוך החדר. שסתום אבי העורקים עלונים מורכבים תאים ביניים מושעה בתוך המטריצה תאית (ECM) ו מכוסים monolayer תא האנדותל. השסתום עמיד סביבה קשים, דינמי חשוף כל הזמן גזירה, כפיפה, מתח, דחיסה. מחקרים הראו נגעים calcific ב שסתומים חולה להתרחש באזורים של לחץ מכני גבוה כתוצאה של הפרעה או נזק אנדותל מטריצה ביניים 1-3. לפיכך, אין זה מפתיע כי מחקרים אפידמיולוגיים הראו לחץ דם גבוה להיות גורם סיכון המובילות תחילת המחלה שסתום אבי העורקים 4.
האפשרות היחידה העומדת כיום לטיפול במחלה הוא החלפת המסתם כירורגית של המסתם הפגוע עם שסתום מכני או bioprosthetic 5. הבנה משופרת של הביולוגיה שסתום בתגובה מדגיש גופנית תעזור להבהיר את מנגנוני הפתוגנזה שסתום. בתורו, זה יכול לעזור בפיתוח של טיפולים לא פולשניים כגון התערבות מניעה או תרופות. Bioreactors פותחו מספר קודם ללמוד את mechanobiology של מסתמי הלב יליד או מהונדסים 6-9. Bioreactors pulsatile יש גם פותחו ללמוד מגוון רחב של רקמות, כולל 10 סחוס, עצם 11 ושלפוחית השתן 12. מטרת עבודה זו היתה לפתח מערכת לחצים מחזורית שניתן להשתמש בו על מנת להבהיר את התגובה הביולוגית של עלונים שסתום אבי העורקים אל המון לחץ מוגבר.
המערכת כללה תא אקרילי שבו למקום דגימות לייצר לחץ מחזורית, סולנואיד Viton הסרעפת שסתומים לשלוט בעיתוי של המחזור לחץ, מחשב כדי לשלוט מכשירים חשמליים. הלחץ היה פיקוח באמצעות מתמר הלחץ, את האות הותנה בעזרת מרכך תא העומס. תוכנית LabVIEW מוסדר את הלחץ באמצעות מכשיר אנלוגי משאבת אוויר דחוס לתוך המערכת בקצב המתאים. המערכת חיקה את רמות הלחץ הדינמי transvalvular הקשורים שסתום אבי העורקים, גל שן ראה המיוצר עלייה הדרגתית בלחץ, אופייני שיפוע הלחץ transvalvular כי קיים על פני המסתם במהלך דיאסטולה, ואחריו ירידה חדה בלחץ המתארות פתיחת שסתום התכווצות. התוכנית LabVIEW מותר למשתמשים לשלוט על עוצמת ותדירות לחץ מחזורית. המערכת הצליחה נושא דגימות רקמה לתנאי הלחץ פיזיולוגיים ופתולוגיים. מכשיר זה יכול לשמש כדי להגביר את הבנתנו כיצד מסתמי הלב להגיב לשינויים בסביבה מכני המקומית.
Protocol
1. רקמות קציר הכנה
- שסתומים אבי העורקים צריכה להיות שנאספו חזירים מבוגר במשקל של לא יותר מ 120 £ מיד לאחר מותו.
- שטפו את השסתומים פעמיים עם פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים (PBS) הובלה למעבדה על הקרח.
- כל הצעדים הבאים צריכים להתבצע בתנאים סטריליים.
- ודא כי הכרוזים אינם מראים כל סימן של ניוון, קריעה או הסתיידות. הסר כרוזים מן השורש על ידי חיתוך אבי העורקים 1 / 3 של המרחק annulus.
- המקום עלונים בבארות בודדים של צלחת שישה היטב דגירה לילה עם בינוני השתנה הנשר 3ml של Dulbecco להשלים עם פתרון anti-biotic/anti-mycotic 1% ו -10% בסרום שור העובר על 37 ° C ו 5% CO 2.
- כחלופה, תאים מבודדים ניתן seeded לתוך שש צלחות היטב בתרבות בשימוש במכשיר לחץ. בידוד של תאים שסתום אנדותל ותאים ביניים יכול להתבצע כפי שתואר לעיל 13, 14.
2. לחץ מחקרים
- מערכת מחוייט לחץ תוכנן כדי לחקור את ההשפעות של הלחץ mechanobiological מחזורית על רקמת שסתום אבי העורקים 15.
- היכנס למחשב, לפתוח את התוכנית LabVIEW (איור 1).
- כיול:
- לפני ניסויים, המערכת צריכה להיות מכויל כראוי.
- חבר את ספק הכוח המעגל. זה מספק הכוח שסתומים סולנואיד כי שליטה על זרימת האוויר לתוך ומחוץ לתא.
- ודא אוויר דחוס הוא מחובר למערכת ולפתוח את אספקת האוויר למהירות מלאה.
- הפעל את המגבר האות. ודא קריאת מתח 0.00. כוון לפי הצורך
- ממשק LabVIEW יש מתג מסומן "TEST / שיא". ודא את המתג מוגדר "TEST". לחץ על הלחצן שכותרתו "אספקת אוויר" כדי לפתוח את שסתום היניקה סולנואיד.
- באמצעות ווסת לחץ הגז, לחצים על החדר עם אוויר דחוס ב 1 PSI. הלחץ בתא ניתן לקרוא באמצעות מד לחץ דיגיטלי הממוקם על הקצה האחורי צלחת של החדר. לאחר הלחץ יש equilibrated, להקליט את הקריאה מתח מ מגבר את האות. חזור עבור PSI 2, 3, 4 ו -5.
- בניית עקומת כיול של לחץ מול מתח. הלחץ צריך להיות המרה ל PSI מ"מ כספית. המשוואה מן הגרף ניתן להציב לתוך הקוד של התוכנית LabVIEW
- הסר את הלוח הקדמי אלומיניום מבית הבליעה לחץ ולרסס את החדר עם אתנול 70%. השאירו למשך תקופה מינימלית של 10 דקות כדי לאפשר אדי אתנול שיורית להתפוגג.
- מניחים את צלחת שש היטב המכילה את דגימות כרוז אל תוך החדר ולהחליף את צלחת הקדמי. ודא החותם הוא אטום על ידי הידוק אגוזים ממוקמת על ארבעה מוטות הברגה (נמצא בכל פינה של צלחת סוף) ביד. הנח את תא הלחץ ב 37 מעלות צלזיוס חממה. תרשים סכמטי של תא הלחץ שמוצג באיור 2.
- ממשק תנחה את המשתמש על מנת לספק את כמות הזמן בין מחזורי מערכת קלט ופלט אוויר דחוס. אלה צריך להיות מוגדר התנאים הסיסטולי והדיאסטולי ואת 0.6s ו 0.4s לחקות, בהתאמה, בתדר של 1Hz. המשתמש צריך גם להזין נתיב קובץ הנתונים.
- ב LabVIEW, לחץ לרוץ לעבור "מבחן / RECORD" לעבור את "שיא".
- ודא הלחץ הוא ברמה הרצויה באמצעות גרף על ממשק LabVIEW. לחץ יכול להיות מותאם באמצעות ווסת לחץ הגז.
- הפעלת התוכנית לאורך הזמן הרצוי.
- לאחר הניסוי הושלם, לחץ על כפתור לעצור על LabVIEW, לכבות את אספקת האוויר ולפתוח את שסתום הפליטה על תא הלחץ.
- הסר את צלחת הקצה הקדמי של החדר ולאחזר שש דגימות גם צלחת ובה. דוגמאות ניתן כעת ניתח עבור ביטוי גנים, ביטוי חלבון, היסטולוגיה, תכונות מכניות וכו '
3. נציג תוצאות:
מערכת הלחץ הוא מסוגל לדמות את הלחצים transvalvular המרבי נצפה תחת normotensive, יתר לחץ דם בשלב התנאים ואני בשלב II. עם זאת, הלחץ לא היה מסוגל לחקות את הלחץ הסיסטולי הדרגתי, שהוא בעצם אפס in vivo. תדירות נשמר 1Hz, עם זמן אוויר מפרצון של 0.6s ואת זמן פליטה של 0.4s. נציג גל הלחץ של התנאים לחץ נורמלי גבוהות המתקבל המערכת ניתן לראות באיור 3.
איור 1: צילום מסך של ממשק LabVIEW.
איור 2: ציור סכמטי של תא הלחץ להציג א איזומטרי של תא הלחץ, להציג צד ב 'של תא הלחץ;נוף ג לראש תא הלחץ.
איור 3: תרשים של סימולציה לחץ בתוך תא הלחץ (A) normotensive, (ב) שלב I יתר לחץ דם, ו - (ג) שלב II תנאים יתר לחץ דם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המערכת חשופה ללחץ בהצלחה עלונים שסתום אבי העורקים ללחצים מחזורית שהיו נציג הלחץ הדיאסטולי transvalvular. עם זאת, לא הצליחה לחקות את הלחץ הסיסטולי transvalvular, כמו הלחץ רק ירד ל 40 מ"מ כספית. לחץ Transvalvular ההבדל בין הלחץ באבי העורקים העולה ואת החדר השמאלי. במהלך דיאסטולה, כאשר שסתום סגור, ההבדל הלחץ 80mmHg בתנאים normotensive ו 90 מ"מ כספית ו 100mmHg בשלב I ו-II שלב יתר לחץ דם, בהתאמה. במהלך התכווצות, כאשר השסתום פתוח, ההבדל בלחץ בין החדר השמאלי לבין האאורטה עולה הוא אפס. השינויים המתרחשים הסלולר המחלה שסתום אבי העורקים הם האמינו להיות קשור ללחץ דיאסטולי גבוה, ולכן, העובדה שהלחץ לא נופל לאפס לא יכול להיות הדאגה העיקרית. זו מבוססת על ההנחה כי הוא גודל הלחץ ולא משרעת הלחץ הוא הכוח המניע מאחורי תגובות ביולוגיות. הקטנת הלחץ של 100 מ"מ כספית ל 0 mmHg דורש 1.20 ± 0.04s, דיווח מניתוח נתונים של 20 מחזורי בלחץ. מאז את כמות הזמן שסתום אבי העורקים נסגר הוא כ 2 / 3 של מחזור הלב, זרם של אוויר לתוך תא הלחץ ידרוש 2.4s כדי ליצור את האיזון אותו פתיחת וסגירת השסתומים מנוסה בתנאים פיסיולוגיים. כתוצאה מכך, בתדירות של Hz .28 ישמשו לבדיקת ההשפעות של הסיסטולי וגם הדיאסטולי רמות הלחץ transvalvular על mechanobiology שסתום אבי העורקים. עם זאת, אם הן הסיסטולי והלחץ הדיאסטולי transvalvular יש מדומה בתדר הפיזיולוגי של 1 הרץ, משאבת ואקום המאגר יכול להיות מצויד שסתום סולנואיד הפליטה. משאבת ואקום יכול להיות מוגדר להסיר סכום קבוע של לחץ כל כך כאשר שסתום הפליטה נפתח, כמות האוויר הנדרשת לחלוטין להפחית את הלחץ מרמת הלחץ להגדיר יפלו לתוך המאגר ואקום. הסרת הלחץ היה ליצור סביבת 0 מ"מ כספית, שם נרדף הלחץ הסיסטולי transvalvular. לעומת זאת, כאשר שסתום הפליטה נסגר, הוואקום כבר לא משפיעים על קאמרית תאפשר להגדיל את הלחץ באמצעות אוויר דחוס. מלבד באמצעות משאבת ואקום כדי להתקרב לחקות מצבים פיזיולוגיים, שסתום פליטה בקוטר גדול יותר יכול לשמש כדי להוריד את הלחץ בתוך bioreactor מהר יותר. נכון לעכשיו, 3 / 8 "קוטר שסתום הפליטה סולנואיד יש קצב זרימה של 3.3 ליטר לדקה (ב 60 מעלות, משקל סגולי של 1), ואילו, שסתום פליטה עם 2" בקוטר יש קצב זרימה של 28.0 ליטר דקה. סולנואיד יותר מסתם בקוטר יותר וחסכונית יותר מאשר באמצעות משאבת ואקום, אולם הוא לא יוכל להפיל את הלחץ לחלוטין לאפס בטווח הפיזיולוגי ולכן יש לבחון אותה. לחלופין, שסתומי סולנואיד מספר מופעלות על ידי מעגל הבקרה באותו לפתוח בו זמנית ניתן להוסיף, ובכך "עיבוד מקבילי" יצוא גז.
המערכת יכולה להיות מופעל באופן רציף באמצעות in-house אוויר דחוס. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בגן חריפה וביטוי חלבון יכול להתרחש תוך שעתיים 16, 17. עם זאת, משך הזמן הזה עלול שלא להספיק ללמוד ביטוי חולף גן / חלבון או שינויים פנוטיפ הסלולר כתוצאה של לחץ מכני. החיסרון של שימוש באוויר דחוס היא כי הגז אינו מכיל 5% CO 2, שהינה חשובה לבקרת pH של המדיום לתרבות. ניתן להתגבר על ידי הוספת מאגר hepes למדיום. כמו כן, התאים לייצר CO 2 כמוצר פסולת מטבולית. הפרשת ה-CO 2 מן הרקמה יהיה גם למנוע את המדיום להיות בסיסיים.
בנוסף בדיקת שסתומי העורקים בלחצים משתנים, זה עשוי להיות נבון כדי לחקור את ההשפעות של תדרים שונים גם כן. לדוגמה, את ההשפעות של שינויים בקצב הלב לפני, במהלך, ואחרי הניתוח יכול להבהיר שינויים בביטוי החלבונים בתוך השסתום. הפרעות קצב לאחר הניתוח להתרחש עד 20% מהחולים 18-21. התוכנית LabVIEW המשמש מערכת זו מאפשרת למשתמש לבחור את אורך זמן אוויר נכנס ויוצא את החדר, ולכן תדירות של מחזור יכול בקלות להיות מותאם. המכשיר מאפשר תדר מרבי של 1.5Hz (90bpm) עקב כמות הזמן הנדרשת כדי למצות את הלחץ מבית הבליעה. כפי שניתן לראות באיור 3, ירידה בלחץ העיקריים שחלו 0.2s הראשון לאחר הפעלת שסתום הפליטה, ואז ירד בהדרגה הלחץ שיורי עבור 0.2s הנותרים של פליטה. הירידה בלחץ הממוצע 0.2s הראשונית של הפליטה היה 45.8 ± 0.34mmHg, בהסתכלות 20 מחזורי בלחץ. בהתחשב בכך שלב II לבדיקת התנאים יתר לחץ דם רק דורש לחץ אופניים בין 60-100 מ"מ כספית לפחות, בתדירות של 1.5 הרץ מאפשר 0.22s עבור הפליטה, אשר טים בשפעדואר לירידה של 40 מ"מ כספית בלחץ. אם משאבת ואקום מחוברת שסתום הפליטה, זה יכול להקל טיפה מהר יותר הלחץ יאפשרו בדיקות בתדירות גבוהה יותר. תדירות מינימלית של bioreactor אינו מוגבל, עם זאת, כי הרגולטור הלחץ עלולה לאפשר זרימה איטית של אוויר, שסתום הפליטה היה מספיק זמן כדי להוריד את הלחץ בתוך הכור.
לסיכום, מערכת התרבות סטרילי נבנה כדי לאפשר את המחקר vivo לשעבר של mechanobiology חזירי לב שסתום אבי העורקים. הלחץ בתוך bioreactor אופניו בין רמות הלחץ הדיאסטולי transvalvular עבור מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. כדי לענות על דרישות המערכת, bioreactor היה קומפקטי ולכן יכול להיות בתוך חממה humidified כדי לשמור על טמפרטורת רקמה על 37 ° C. יתר על כן, גודל הלחץ ואת התדירות נשלטו באופן עצמאי, המאפשר מגוון רחב של תנאים כדי להיחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים שאד Schipke ודניאל Chesser עזרתם בעיצוב ייצור של המערכת מיילס Valtresa לסיוע בהכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
