Summary
Eine zyklische Druck Bioreaktor in der Lage zu unterwerfen Herzklappengewebe zu physiologischen und pathologischen Druckverhältnisse ausgelegt ist. Ein LabVIEW-Programm ermöglicht es Benutzern, Druck Größe, Amplitude und Frequenz-Steuerung. Dieses Gerät kann verwendet werden, um die Mechanobiologie der Herzklappe Gewebe oder isolierte Zellen zu studieren.
Abstract
Die Aortenklappe zwischen der linken Herzkammer und der Aorta befindet, ermöglicht die unidirektionale Durchblutung und verhindert Rückfluss in die Herzkammer. Aortenklappensegel sind der interstitiellen Zellen innerhalb einer extrazellulären Matrix (ECM) suspendiert und mit einer endothelialen Monolayer gesäumt zusammen. Das Ventil hält eine harte, dynamischen Umfeld und ist ständig zu scheren, Flexion, Spannung und Kompression ausgesetzt. Die Forschung hat calcific Läsionen in erkrankten gezeigten Ventile kommen in Bereichen mit hoher mechanischer Belastung als Folge der endothelialen Störung oder interstitielle Matrix Schaden 1-3. Daher ist es nicht verwunderlich, dass epidemiologische Studien haben hohen Blutdruck, eine führende Risikofaktor bei der Entstehung von Aortenvitien 4 dargestellt.
Die einzige Behandlungsmöglichkeit, die jetzt bei Herzklappenerkrankungen ist die chirurgische Ersatz des erkrankten Ventil mit einem bioprothetischen oder mechanische Ventil 5. Verbessertes Verständnis des Ventils Biologie in Reaktion auf körperliche Belastungen helfen würde, Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese Ventil. Im Gegenzug könnte dies in der Entwicklung von nicht-invasive Therapien wie pharmazeutische Intervention oder Prävention zu helfen. Mehrere Bioreaktoren wurden bereits entwickelt, um die Mechanobiologie von nativen oder Herzklappen 6-9 studieren. Pulsierende Bioreaktoren sind auch entwickelt worden, um einer Reihe von Geweben einschließlich Knorpel 10, 11 und Knochen Blase 12 zu studieren. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine zyklische Druck-System, verwendet, um die biologische Reaktion der Aortenklappensegel zu einer erhöhten Druckbelastung klären könnten zu entwickeln.
Das System bestand aus einem Acryl-Kammer, in der Proben Ort und produzieren zyklische Druck, Viton Membrane Magnetventile, um das Timing der Druck Zyklus zu steuern, und einen Computer, um elektrische Geräte zu steuern. Der Druck wurde unter Verwendung eines Druckaufnehmer, und das Signal war bedingt durch eine Kraftmessdose Conditioner. Ein LabVIEW-Programm reguliert den Druck mit einem analogen Gerät mit Druckluft ins System zu pumpen an der entsprechenden Rate. Das System imitiert die dynamische transvalvuläre Druckniveaus mit der Aortenklappe verbunden, eine Sägezahnwelle produziert eine schrittweise Erhöhung des Drucks, die typisch für die transvalvuläre Druckverlauf, der derzeit über dem Ventil ist während der Diastole, durch einen scharfen Druckabfall darstellt Ventilöffnung in gefolgt Systole. Die LabVIEW-Programm erlaubt Benutzern, das Ausmaß und die Häufigkeit der zyklische Druck zu kontrollieren. Das System war in der Lage, um Gewebeproben zu physiologischen und pathologischen Druckverhältnissen unterworfen. Dieses Gerät kann verwendet werden, um unser Verständnis, wie Herzklappen, um Änderungen in der lokalen mechanischen Umfeld zu reagieren erhöhen.
Protocol
1. Tissue Ernte und Zubereitung
- Aortenklappen sollte von ausgewachsenen Schweinen mit einem Gewicht von nicht mehr als £ 120 unmittelbar nach dem Tod gesammelt werden.
- Waschen Sie die Ventile zweimal mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Transport ins Labor auf Eis.
- Alle weiteren Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Stellen Sie sicher, dass Flugblätter zeigen keine Anzeichen von Degeneration, Reißen oder Verkalkung. Entfernen Sie Prospekte von der Aortenwurzel, indem 1 / 3 des Abstandes von der Ring.
- Ort Flugblätter in einzelnen Vertiefungen einer sechs-Well-Platte und inkubieren mit 3ml Dulbeccos Modified Eagle Medium mit 1% anti-biotic/anti-mycotic-Lösung und 10% fötalem Rinderserum bei 37 ° C und 5% CO 2 ergänzt Nacht.
- Als Alternative isolierten Zellen lassen sich in sechs-well-Platten ausgesät werden und in der Druck-Gerät. Isolation des Ventils Endothelzellen und interstitiellen Zellen kann wie bisher 13, 14 beschrieben werden.
2. Pressure Studies
- Eine maßgeschneiderte Druck-System wurde entwickelt, um die mechanobiological Auswirkungen von zyklischen Druck auf Aortenklappe Gewebe 15 zu studieren.
- Melden Sie sich an den Computer und öffnen Sie die LabVIEW-Programm (Abbildung 1).
- Kalibrierung:
- Vor Experimenten, sollte das System korrekt kalibriert werden.
- Schließen Sie das Netzteil an die Platine. Dieser versorgt die Magnetventile, dass der Luftstrom in und aus der Kammer zu steuern.
- Achten Sie darauf, die Druckluft an das System angeschlossen ist, und öffnen Sie die Luftzufuhr in voller Geschwindigkeit.
- Schalten Sie den Signalverstärker. Achten Sie darauf, die Spannung zu lesen ist 0,00. Passen Sie bei Bedarf
- Die LabVIEW-Schnittstelle verfügt über einen Schalter mit der Aufschrift "TEST / RECORD". Sicherstellen, dass die Schalter auf "TEST". Klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Aufschrift "Air Supply" mit dem Einlass-Magnetventil geöffnet.
- Mit dem Gas-Druckregler, Druck der Kammer mit Druckluft bei 1 PSI. Der Druck in der Kammer kann mit dem digitalen Manometer an der hinteren Endplatte der Kammer befinden. Sobald der Druck äquilibriert, notieren Sie die Spannung Lesung aus dem Signalverstärker. Wiederholen Sie für 2, 3, 4 und 5 PSI.
- Konstruieren Sie eine Eichkurve Druck vs Spannung. Der Druck sollte von PSI zu mmHg umgewandelt werden. Die Gleichung von der Grafik kann in den Code der LabVIEW-Programm platziert werden
- Entfernen Sie die Aluminium-Frontplatte aus der Druckkammer und besprühen Sie die Kammer mit 70% Ethanol. Lassen Sie für ein Minimum von 10 Minuten, damit Restethanol Dämpfe zu zerstreuen.
- Legen Sie die Sechs-Well-Platte mit dem Flugblatt Proben in der Kammer und ersetzen Sie die vordere Endplatte. Sicherstellen, dass die Dichtung luftdicht ist durch Anziehen der Muttern auf die vier Gewindestangen (befindet sich an jeder Ecke der Endplatte) von Hand entfernt. Legen Sie die Druckkammer in der 37 ° C Inkubator. Eine schematische Darstellung der Druckkammer ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Die Schnittstelle wird der Benutzer aufgefordert, die Zeit, das System Zyklen zwischen Druckluft-und Ausgang bietet. Diese sollten auf 0,6 Sekunden und 0,4 Sekunden zu imitieren diastolischen und systolischen Bedingungen bzw. bei einer Frequenz von 1 Hz eingestellt werden. Der Benutzer sollte auch einen Datei-Pfad.
- In LabVIEW, klicken Sie laufen und schalten Sie den "TEST / RECORD" toggle auf "RECORD".
- Vergewissern Sie sich, der Druck auf dem gewünschten Niveau mit der Grafik auf der LabVIEW-Schnittstelle. Der Druck kann mit dem Gasdruckregler werden.
- Run-Programm für die gewünschte Länge der Zeit.
- Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Stopp-Taste auf LabVIEW, schalten Sie Luftzufuhr und öffnen Sie das Auslassventil auf der Druckkammer.
- Entfernen Sie die vordere Endplatte aus der Kammer und Abrufen von sechs Well-Platte mit Proben. Muster können ab sofort für die Genexpression, Proteinexpression, Histologie, mechanische Eigenschaften usw. analysiert werden
3. Repräsentative Ergebnisse:
Der Druck ist für die Simulation maximale transvalvuläre Drücke unter normotensiven beobachtet, Stufe I und Stufe II hypertensive Bedingungen. Allerdings war der Druck nicht in der Lage, den systolischen Druckgradienten, die im wesentlichen Null ist in vivo nachahmen. Die Frequenz ist bei 1 Hz erhalten, mit einem Lufteinlass Zeit 0.6s und eine Abgas-Zeit von 0,4 Sekunden. Vertreter Druckkurven von normalen und erhöhten Druck Bedingungen aus dem System erhalten können in Bild 3 zu sehen.
Abbildung 1: Screenshot der LabVIEW-Schnittstelle.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Druckkammer A. Isometrische Ansicht der Druckkammer; B. Seitenansicht der Druckkammer;C. Draufsicht Druckkammer.
Abbildung 3: Graph der Druck-Simulation in der Druckkammer bei (A) normotensiven, (B) Stadium I hypertensive und (C) Stufe II hypertensive Bedingungen.
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Discussion
Der Druck-System erfolgreich Aortenklappensegel zyklische Belastungen, die Vertreter der diastolische Druck transvalvuläre ausgesetzt waren. Allerdings war es nicht möglich, systolische Druck transvalvuläre imitieren, da der Druck nur sank auf 40 mmHg. Transvalvuläre Druck ist der Unterschied zwischen dem Druck in der Aorta ascendens und des linken Ventrikels. Während der Diastole, wenn das Ventil geschlossen ist, wird die Druckdifferenz unter normotensiven Bedingungen und 90 mmHg 80mmHg und 100 mmHg im Stadium I und Stadium II Hypertonie bzw.. Während der Systole, wenn das Ventil geöffnet ist, wird die Druckdifferenz zwischen der linken Herzkammer und der Aorta ascendens Null. Die zellulären Veränderungen, die in Aortenvitien auftreten, sind vermutlich mit hohen diastolischen Druck in Verbindung gebracht werden, daher die Tatsache der Druck nicht auf Null fallen können, nicht ein wichtiges Anliegen sein. Dies beruht auf der Annahme, dass es Druck Größe und nicht Druckamplitude, dass die treibende Kraft hinter biologischen Reaktionen ist basiert. Die Reduzierung der Druck von 100 mmHg auf 0 mmHg erfordert 1,20 ± 0,04 s, aus der Datenanalyse von 20 Druckzyklen berichtet. Da die Menge an Zeit, die Aortenklappe geschlossen ist ca. 2 / 3 des Herzzyklus, würde der Zustrom von Luft in die Druckkammer erfordern 2.4s auf die gleiche Balance zwischen Ventilöffnung erstellen und Schließen in physiologischen Bedingungen erlebt. Als Ergebnis würde eine Frequenz von 0,28 Hz für die Prüfung der Auswirkungen des systolischen und diastolischen transvalvuläre Druckniveaus auf Aortenklappe Mechanobiologie verwendet werden. Allerdings könnte, wenn den systolischen und diastolischen Druck transvalvuläre, die bei einer physiologischen Frequenz von 1 Hz, einer Vakuumpumpe und Reservoir simuliert werden, um die Abgas-Magnetventil eingebaut werden. Die Vakuumpumpe setzen konnte, um einen festen Betrag an Druck so zu entfernen, wenn das Auslassventil öffnet, würde die Menge an Luft benötigt, um vollständig zu reduzieren den Druck von den eingestellten Druck Ebene in die Vakuum-Speicher gezogen werden. Das Entfernen der Druck würde eine 0 mmHg Umwelt, gleichbedeutend mit einem systolischen transvalvuläre Druck. Umgekehrt, wenn das Auslassventil schließt, wird das Vakuum nicht mehr auf die Kammer und würde den Druck auf über Druckluft zu erhöhen. Neben der Verwendung einer Vakuumpumpe näher imitieren physiologischen Bedingungen kann ein Auslassventil mit einem größeren Durchmesser verwendet werden, um den Druck innerhalb des Bioreaktors schneller fallen zu lassen. Derzeit "hat einen Durchmesser Entlüftungs-Magnetventil einer Fließgeschwindigkeit von 3,3 Gallonen pro Minute (bei 60 ° C, spezifisches Gewicht von 1); der Erwägung, dass ein Auslassventil mit einem 2" die 3 / 8 Durchmesser hat eine Fließgeschwindigkeit von 28,0 Liter pro Minute. Ein größerer Durchmesser Magnetventil ist kostengünstiger als die Verwendung einer Vakuumpumpe, aber es darf nicht in der Lage sein, den Druck komplett auf Null fallen innerhalb der physiologischen Bereich und sollte daher weiter untersucht werden. Alternativ könnten mehrere Magnetventile von der gleichen Regelkreis ausgelöst, die gleichzeitig offen zugegeben werden, wodurch die "parallel-processing" der Gasaustritt.
Das System konnte kontinuierlich betrieben mit in-house Druckluft werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass akute Veränderungen in der Gen-und Protein-Expression kann innerhalb von zwei Stunden 16, 17 auftreten. Allerdings kann diese Dauer nicht ausreichen, um transiente Gen / Protein-Expression oder Veränderungen in der zellulären Phänotyp als Folge der mechanischen Belastung zu studieren. Der Nachteil der Verwendung von Druckluft ist, dass das Gas nicht enthalten 5% CO 2, was wichtig für die Steuerung des pH des Kulturmediums ist. Dies kann durch Zugabe Hepes-Puffer auf das Medium zu überwinden. Auch produzieren die Zellen CO 2 als Stoffwechselprodukt Abfallprodukt. Sekretion von CO 2 aus dem Gewebe wird auch verhindert, das Medium immer einfach.
Zusätzlich zu den Tests Aortenklappen bei unterschiedlichen Drücke, kann es auch sinnvoll, um die Auswirkungen der unterschiedlichen Frequenzen sowie zu studieren. Zum Beispiel könnten die Auswirkungen von Veränderungen in der Herzfrequenz vor, während und nach der Operation Veränderungen der Proteinexpression im Ventil zu erläutern. Postoperative Arrhythmien treten bei bis zu 20% der Patienten 18-21. Die LabVIEW-Programm für dieses System verwendet kann der Benutzer die Länge der Zeit Luft tritt wählen und verlässt den Raum, daher die Frequenz des Zyklus kann einfach eingestellt werden. Das Gerät ermöglicht eine maximale Frequenz von 1,5 Hz (90bpm) durch die benötigte Zeit, um den Druck aus der Kammer zu erschöpfen. Wie in Abbildung 3, einem großen Druckabfall in den ersten 0,2 s nach dem Auslassventil Aktivierung aufgetreten gesehen, dann allmählich zurück, um den Restdruck für die restlichen 0,2 s von Abgas. Die durchschnittliche Druckabfall in den ersten 0,2 s von Abgas war 45,8 ± 0.34mmHg, über 20 Druckzyklen gemessen. Da die Prüfung der Stufe II hypertensive Bedingungen erfordert nur Radfahren Druck zwischen bei 60-100 mmHg, einer Frequenz von 1,5 Hz 0.22s ermöglicht Auspuff, ist die reichliche time zu fallen 40 mmHg Druck. Wenn eine Vakuumpumpe an das Auslassventil angebracht ist, könnte es erleichtern, eine schnellere Druckabfall und würden höhere Frequenz-Analyse. Die minimale Frequenz des Bioreaktors ist nicht begrenzt, jedoch wegen der Druckregler ermöglichen könnte langsam Zustrom von Luft und das Auslassventil würde ausreichend Zeit, um den Druck innerhalb des Reaktors Drop haben.
Abschließend wurde eine sterile Kultur System konstruiert worden, um die Ex-vivo-Studie von Schweine-Aorten-Herzklappe Mechanobiologie ermöglichen. Der Druck innerhalb des Bioreaktors zyklisch zwischen diastolischen transvalvuläre Druckniveaus für physiologische und pathologische Zustände. Um den Systemanforderungen, wurde der Bioreaktor kompakt und konnte daher in einem befeuchteten Inkubator enthalten sein, um Gewebe Temperatur bei 37 ° C zu halten Darüber hinaus wurden die Druck-Amplitude und Frequenz unabhängig voneinander geregelt, so dass eine Vielzahl von Bedingungen untersucht werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Shad Schipke und Daniel Chesser für ihre Hilfe bei der Konstruktion und Fertigung des Systems und Valtresa Myles für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
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