Summary
एक चक्रीय दबाव शारीरिक और रोग दबाव की स्थिति के लिए हृदय वाल्व ऊतक subjecting के सक्षम bioreactor डिजाइन किया गया है. एक LabVIEW कार्यक्रम उपयोगकर्ताओं को दबाव परिमाण आयाम और आवृत्ति को नियंत्रित करने के लिए अनुमति देता है. इस डिवाइस को हृदय वाल्व ऊतक या अलग कक्षों की mechanobiology का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. ऊतक हार्वेस्ट और तैयार
- महाधमनी वाल्व वयस्क मृत्यु के तुरंत बाद 120 से अधिक नहीं एलबीएस वजन सूअरों से एकत्र होना चाहिए.
- वाल्व बाँझ फॉस्फेट के साथ दो बार धो buffered खारा (PBS) और बर्फ पर प्रयोगशाला के लिए परिवहन.
- सभी बाद के चरणों का बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए.
- सुनिश्चित करें कि पत्रक अध: पतन के किसी भी हस्ताक्षर नहीं दिखा, उद्धत या कड़ा हो जाना. वलय से 1 / 3 दूरी के काटने से महाधमनी जड़ से पत्रक निकालें.
- एक छह अच्छी तरह से थाली के अलग - अलग कुओं में जगह पत्रक और 3ml है Dulbecco संशोधित ईगल 1% anti-biotic/anti-mycotic समाधान और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक मध्यम के साथ रात भर सेते हैं.
- के रूप में एक वैकल्पिक, अलग कक्षों छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और दबाव डिवाइस में इस्तेमाल किया. वाल्व endothelial कोशिकाओं और बीचवाला कोशिकाओं के अलगाव के रूप में पहले 13, 14 में वर्णित किया जा सकता है.
2. दबाव अध्ययन
- एक कस्टम बनाया दबाव प्रणाली चक्रीय दबाव के महाधमनी वाल्व 15 ऊतक पर mechanobiological प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है.
- कंप्यूटर पर लॉग ऑन करें और LabVIEW (चित्रा 1) कार्यक्रम खुला.
- अंशांकन:
- प्रयोग करने के लिए पहले, सिस्टम ठीक से calibrated किया जा चाहिए.
- सर्किट बोर्ड के लिए सत्ता की आपूर्ति कनेक्ट. इस solenoid वाल्व कि हवा के प्रवाह में और से बाहर कक्ष नियंत्रण के लिए शक्ति प्रदान करता है.
- यकीन है कि संपीड़ित हवा प्रणाली से जुड़ा है और पूर्ण वेग के लिए हवा की आपूर्ति खुला.
- संकेत एम्पलीफायर पर मुड़ें. सुनिश्चित करें कि वोल्टेज पढ़ने 0.00 है. आवश्यक के रूप में समायोजित
- Labview इंटरफ़ेस स्विच "टेस्ट रिकॉर्डः /" के रूप में चिह्नित है. सुनिश्चित करें कि स्विच करने के लिए "टेस्ट" करने के लिए सेट कर दिया जाता है. "एयर आपूर्ति" इनलेट solenoid वाल्व खोलने के रूप में चिह्नित बटन पर क्लिक करें.
- गैस के दबाव नियामक का प्रयोग, संपीड़ित हवा के साथ एक साई पर चैम्बर दबाव. कक्ष में दबाव डिजिटल दबाव चैम्बर के रियर अंत प्लेट पर स्थित गेज का उपयोग करके पढ़ा जा सकता है है. एक बार दबाव equilibrated है, संकेत एम्पलीफायर से वोल्टेज पढ़ने के रिकॉर्ड. 2, 3, 4, और 5 साई के लिए दोहराएँ.
- दबाव बनाम वोल्टेज के अंशांकन वक्र निर्माण. दबाव साई से mmHg के लिए परिवर्तित किया जाना चाहिए. ग्राफ से समीकरण LabVIEW कार्यक्रम के कोड में रखा जा सकता है है
- दबाव कक्ष से एल्यूमीनियम सामने थाली निकालें और 70% इथेनॉल के साथ चैम्बर स्प्रे. अवशिष्ट इथेनॉल धुएं को फैलने के लिए अनुमति देने के 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए छोड़ दें.
- छह अच्छी तरह से चेंबर में पत्रक नमूने युक्त थाली प्लेस और सामने अंत प्लेट की जगह. सुनिश्चित करें मुहर चार हाथ से लड़ी पिरोया rods (अंत थाली के प्रत्येक कोने पर स्थित) पर स्थित नट कस द्वारा airtight है. 37 ° सी इनक्यूबेटर में दबाव चैम्बर रखें. दबाव चैम्बर के एक योजनाबद्ध आरेख आंकड़ा 2 में दिखाया गया है.
- अंतरफलक उपयोक्ता को प्रांप्ट करने संपीड़ित हवा इनपुट और आउटपुट के बीच समय प्रणाली चक्र की राशि प्रदान करेगा. इन 0.6s और नकल 0.4s डायस्टोलिक और सिस्टोलिक शर्तों, 1Hz की एक आवृत्ति पर क्रमशः सेट किया जाना चाहिए. उपयोगकर्ता को भी एक डेटा फ़ाइल पथ दर्ज करना चाहिए.
- LabVIEW में, भागो पर क्लिक करें और "टेस्ट रिकॉर्डः /" "रिकॉर्ड" करने के लिए टॉगल स्विच.
- सुनिश्चित करें कि दबाव वांछित LabVIEW अंतरफलक पर ग्राफ का उपयोग के स्तर पर है. दबाव गैस के दबाव नियामक का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है.
- समय की लंबाई के लिए वांछित प्रोग्राम चलाएँ.
- एक बार प्रयोग पूरा हो गया है, LabVIEW पर रोक बटन क्लिक करें, हवा की आपूर्ति बंद करने और दबाव चैम्बर पर निकास वाल्व खुला.
- कक्ष से सामने अंत की थाली निकालें और छह अच्छी तरह से थाली युक्त नमूनों को पुनः प्राप्त. नमूने अब जीन अभिव्यक्ति, प्रोटीन अभिव्यक्ति, ऊतक विज्ञान, यांत्रिक गुणों आदि के लिए विश्लेषण किया जा सकता है
3. प्रतिनिधि परिणाम:
दबाव प्रणाली normotensive के तहत अधिकतम transvalvular मनाया दबाव का अनुकरण करने में सक्षम है, और मैं चरण द्वितीय उच्च रक्तचाप से ग्रस्त शर्तों मंच. हालांकि, दबाव systolic दबाव ढाल है, जो vivo में अनिवार्य रूप से शून्य है की नकल करने में सक्षम नहीं था. आवृत्ति 1Hz पर 0.6s और 0.4s के एक निकास समय के एक वायुइनलेट समय के साथ बनाए रखा है. सामान्य और ऊंचा दबाव प्रणाली से प्राप्त शर्तों के प्रतिनिधि दबाव waveforms 3 आकृति में देखा जा सकता है है.
चित्रा 1: LabVIEW अंतरफलक के स्क्रीन शॉट.
चित्रा 2: दबाव दबाव चैम्बर के चैम्बर ए Isometric देखने के योजनाबद्ध ड्राइंग, बी दबाव चैम्बर के साइड दृश्य;सी. दबाव चैम्बर के शीर्ष देखने के लिए.
चित्रा 3: (ए) normotensive, (बी) मैं उच्च रक्तचाप से ग्रस्त स्टेज, और (सी) स्टेज द्वितीय उच्च रक्तचाप से ग्रस्त शर्तों पर दबाव सिमुलेशन के दबाव चैम्बर के भीतर ग्राफ़ .
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Discussion
दबाव प्रणाली को सफलतापूर्वक चक्रीय दबाव है कि diastolic transvalvular दबाव के प्रतिनिधि थे महाधमनी वाल्व पत्रक अवगत कराया. हालांकि, यह सिस्टोलिक transvalvular दबाव नकल करने में सक्षम नहीं था दबाव के रूप में केवल 40 mmHg के लिए गिरा दिया. Transvalvular दबाव आरोही महाधमनी और बाएं वेंट्रिकल में दबाव के बीच का अंतर है. पाद लंबा के दौरान, जब वाल्व बंद कर दिया है, दबाव अंतर normotensive शर्तों और 90 mmHg के तहत 80mmHg है और मंच में 100mmHg और मैं चरण द्वितीय उच्च रक्तचाप, क्रमशः. प्रकुंचन के दौरान, जब वाल्व खुला है, बाएं वेंट्रिकल और आरोही महाधमनी के बीच अंतर दबाव शून्य है. सेलुलर परिवर्तन है कि महाधमनी वाल्व की बीमारी में होते हैं उच्च diastolic दबाव के साथ जुड़े होने का विश्वास कर रहे हैं, इसलिए, इस तथ्य यह दबाव शून्य करने के लिए गिर नहीं था एक प्रमुख चिंता का विषय नहीं हो सकता. यह धारणा है कि यह दबाव परिमाण और आयाम है कि जैविक प्रतिक्रियाओं के पीछे असली ताकत है दबाव नहीं है पर आधारित है. 100 mmHg से 0 mmHg दबाव को कम 1.20 ± 0.04s, 20 दबाव चक्र के डेटा विश्लेषण से रिपोर्ट की आवश्यकता है. महाधमनी वाल्व बंद कर दिया है समय की राशि के बाद से लगभग 2 / 3 हृदय चक्र के, हवा के दबाव चेंबर में बाढ़ वाल्व खोलने के समान संतुलन बनाने और समापन शारीरिक स्थितियों में अनुभवी 2.4s की आवश्यकता होगी. एक परिणाम के रूप में .28 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के दोनों systolic और diastolic महाधमनी वाल्व mechanobiology पर transvalvular दबाव स्तर के प्रभाव के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. हालांकि, solenoid वाल्व निकास हो सकता है अगर दोनों systolic और diastolic transvalvular दबाव 1 हर्ट्ज, एक वैक्यूम पंप और जलाशय के एक शारीरिक आवृत्ति में नकली हो रहे हैं फिट सकता है. वैक्यूम पंप दबाव की एक निश्चित राशि इतनी दूर जब निकास वाल्व खुलता है करने के लिए सेट किया जा सकता है, हवा की मात्रा के लिए पूरी तरह से सेट दबाव स्तर से दबाव कम करने के लिए आवश्यक वैक्यूम जलाशय में तैयार होगा. दबाव को हटाने के एक 0 mmHg वातावरण बनाने, सिस्टोलिक transvalvular दबाव के साथ पर्याय. इसके विपरीत, जब निकास वाल्व बंद कर देता है, निर्वात अब कोई कक्ष को प्रभावित करते हैं और दबाव हवा के माध्यम से दबाव बढ़ाने के लिए अनुमति होगी. एक वैक्यूम पंप का उपयोग करने के लिए करीब शारीरिक स्थितियों की नकल करने के अलावा, एक बड़ा व्यास के साथ एक निकास वाल्व bioreactor भीतर दबाव अधिक जल्दी छोड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान में, 3 / 8 "व्यास निकास solenoid वाल्व के प्रवाह की दर प्रति मिनट 3.3 गैलन (60 ° एफ, 1 के विशिष्ट गुरुत्व), जबकि एक 2 के साथ एक निकास वाल्व" व्यास प्रति 28.0 गैलन के प्रवाह की दर है मिनट. एक बड़ा व्यास solenoid वाल्व एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर से अधिक लागत प्रभावी है, लेकिन यह शारीरिक सीमा के भीतर करने के लिए शून्य करने के लिए दबाव पूरी तरह से ड्रॉप करने में सक्षम नहीं हो और इसलिए आगे जांच की जानी चाहिए सकता है. वैकल्पिक रूप से, कई solenoid वाल्व कि एक ही नियंत्रण परिपथ द्वारा ट्रिगर एक साथ खुला, जोड़ा जा सकता है, जिससे "समानांतर प्रसंस्करण" गैस बहिर्वाह.
सिस्टम लगातार संपीड़ित हवा घर में उपयोग कर संचालित किया जा सकता है. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति में तीव्र परिवर्तन दो 16 घंटे, 17 के भीतर हो सकता है. हालांकि, इस अवधि यांत्रिक तनाव का एक परिणाम के के रूप में क्षणिक अभिव्यक्ति जीन प्रोटीन / या सेलुलर phenotype में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता. संपीड़ित हवा का उपयोग करने का दोष यह है कि गैस की 5% 2 सीओ, जो मध्यम संस्कृति के pH को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है शामिल नहीं करता है. इस माध्यम के लिए hepes बफर जोड़ने के द्वारा दूर किया जा सकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं एक चयापचय अपशिष्ट उत्पाद के रूप में सीओ 2 का उत्पादन. सीओ 2 के ऊतकों से स्राव भी बुनियादी बनने मध्यम रोकने जाएगा.
अलग दबाव महाधमनी वाल्व के परीक्षण के अलावा, यह विवेकपूर्ण हो सकता है आवृत्तियों के रूप में अच्छी तरह से अलग करने के प्रभाव का अध्ययन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, पहले दिल की दर में परिवर्तन, के दौरान और सर्जरी के बाद के प्रभाव वाल्व भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन स्पष्ट सकता है. पश्चात arrhythmias 18-21 रोगियों के 20% में होते हैं . LabVIEW इस प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया कार्यक्रम के समय हवा की लंबाई में प्रवेश करती है का चयन करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है और कक्ष पत्ते, इसलिए चक्र की आवृत्ति आसानी से समायोजित किया जा सकता है. 1.5Hz (90bpm) की एक अधिकतम आवृत्ति कक्ष से दबाव निकास के लिए आवश्यक समय की मात्रा के कारण डिवाइस के लिए अनुमति देता है. चित्रा 3 में, एक प्रमुख दबाव निकास वाल्व सक्रियण के बाद पहली 0.2s में हुई कमी में देखा, तो धीरे धीरे निकास के शेष 0.2s के लिए अवशिष्ट दबाव की गिरावट आई है. निकास के प्रारंभिक 0.2s में औसत दबाव ड्रॉप 45.8 ± 0.34mmHg, 20 दबाव चक्र पर मापा था. यह देखते हुए कि स्टेज द्वितीय उच्च रक्तचाप से ग्रस्त शर्तों परीक्षण केवल कम से कम 6-10 mmHg के बीच साइकिल चालन के दबाव की आवश्यकता है, 1.5 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के निकास के लिए 0.22s की अनुमति देता है, जो पर्याप्त टिमई दबाव के 40 mmHg ड्रॉप करने के लिए. यदि एक वैक्यूम पंप निकास वाल्व से जुड़ा हुआ है, यह दबाव में तेजी से ड्रॉप की सुविधा और उच्च आवृत्ति परीक्षण की अनुमति होगी सकता है. bioreactor की न्यूनतम आवृत्ति सीमित नहीं है, तथापि, क्योंकि दबाव नियामक की अनुमति दे सकता है हवा और निकास वाल्व की धीमी गति से बाढ़ रिएक्टर के भीतर दबाव ड्रॉप करने के लिए पर्याप्त समय होता है.
अंत में, एक बाँझ संस्कृति प्रणाली सुअर महाधमनी हृदय वाल्व mechanobiology के पूर्व vivo अध्ययन की अनुमति बनाया गया है. bioreactor भीतर दबाव शारीरिक और रोग की स्थिति के लिए डायस्टोलिक transvalvular दबाव के स्तरों के बीच साइकिल. सिस्टम आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, bioreactor कॉम्पैक्ट गया था और इसलिए एक humidified इनक्यूबेटर के भीतर निहित किया जा सकता है है 37 पर ऊतक का तापमान बनाए रखने डिग्री सेल्सियस इसके अलावा, दबाव परिमाण और आवृत्ति स्वतंत्र रूप से नियंत्रित थे, स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन किया जा करने के लिए अनुमति.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों प्रणाली और पांडुलिपि की तैयारी के साथ सहायता के लिए Valtresa Myles के डिजाइन और निर्माण के साथ उनकी सहायता के लिए शाद Schipke और डैनियल Chesser के लिए आभारी हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
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