Summary
生理学的および病理学的圧力の条件に心臓弁組織を施すことのできる周期的圧力のバイオリアクターを設計されています。 LabVIEWプログラムは、ユーザーが圧力の大きさ、振幅と周波数を制御することができます。このデバイスは、心臓弁の組織または単離された細胞のmechanobiologyを研究するために使用することができます。
Abstract
左心室と大動脈の間にある大動脈弁は、心室に逆流を防止する、単方向の血流が可能になります。大動脈弁尖は、細胞外マトリックス（ECM）内に懸濁し、そして内皮細胞単層で裏打ちされています間質細胞で構成されています。バルブは、過酷な、動的な環境に耐え、絶えずせん断、屈曲、緊張、および圧縮にさらされています。研究は、内皮中断や間質マトリックスの損傷1-3の結果として、高い機械的応力の領域で発生する病気の弁に石灰化病変を示している。したがって、それは疫学的研究は、大動脈弁疾患4の発症の主要な危険因子であることが高血圧を示していることは驚くべきことではない。
弁疾患のため現在入手可能な唯一の治療法の選択肢はbioprostheticまたは機械的なバルブ5と病気の弁の手術の代替品です。物理的なストレスに応答して、バルブの生物学の理解の向上には、バルブの病因のメカニズム解明に役立つだろう。ターンでは、このような薬剤介入や予防などの非侵襲的な治療法の開発に役立つ可能性があります。いくつかのバイオリアクターは、以前はネイティブまたは人工心臓弁6-9のmechanobiologyを研究するために開発されている。拍動性バイオリアクターは、軟骨10、骨11、膀胱12を含む組織の範囲を研究するために開発されている。この作業の目的は、上昇圧力荷重に対する大動脈弁尖の生物学的応答を解明するために使用することができる周期的圧力のシステムを開発することでした。
システムはサンプルを配置し、電気機器を制御するために周期的な圧力、圧力サイクルのタイミングを制御するためにバイトンダイヤフラム電磁弁、およびコンピュータを生産するのアクリルチャンバーから成っていた。圧力は圧力変換器を用いてモニターし、信号はロードセルのコンディショナーを使用して調整した。 LabVIEWプログラムは、適切な速度でシステムに圧縮空気をポンプするために、アナログデバイスを使用して圧力を調節。システムは、大動脈弁に関連付けられている動的な圧較圧レベルを模倣し、鋸歯状の波がでバルブの開度を描いた急激な圧力降下が続く拡張期の間にバルブ前後存在していることを圧較圧力勾配の典型的な圧力が徐々に増加し、生産収縮。 LabVIEWプログラムは、ユーザーが周期的圧力の大きさと周波数を制御することを可能にしました。システムは、生理学的および病理学的圧力の条件に組織サンプルを施すことができた。このデバイスは、心臓弁は、ローカルの機械環境の変化に対応方法についての我々の理解を高めるために使用することができます。
Protocol
1。組織の収穫と準備
- 大動脈弁はすぐに死の後にこれ以上の120を超えるポンドの重量を量る成人豚から収集する必要があります。
- 滅菌リン酸で二回バルブを洗浄する生理食塩水（PBS）と氷の上で研究室への輸送は、バッファリング。
- 後続のすべての手順は、無菌条件下で実行する必要があります。
- そのチラシが裂けたり、石灰化、変性の兆候を示していないことを確認します。アニュラスからの距離の1 / 3をカットすることで大動脈基部からチラシを取り外します。
- 場所のシックスウェルプレートの個々のウェルのチラシと37℃、5％CO 2で1％anti-biotic/anti-mycoticソリューションおよび10％ウシ胎児血清を添加した3ミリリットルダルベッコ変法イーグル培地で一晩インキュベートする。
- 別の、分離した細胞は6ウェル培養プレートに播種し、加圧装置で使用することができますように。以前に13、14を説明するように弁内皮細胞と間質細胞の単離を行うことができます。
2。圧力研究
- カスタムメイドの圧力システムは、大動脈弁の組織15周期的圧力のmechanobiological効果を研究するように設計されています。
- コンピュータにログオンし、LabVIEWのプログラム（図1）を開きます。
- キャリブレーション：
- 実験前に、システムが適切に校正されるべきである。
- 回路基板に電源を接続します。これにより、チャンバ内へと外の空気の流れを制御するソレノイドバルブに電力を供給します。
- 圧縮空気がシステムに接続されていることを確認し、完全な速度に空気の供給を開きます。
- 信号増幅器の電源をオンにします。電圧測定値が0.00であることを確認してください。必要に応じて調整する
- LabVIEWインタフェースは、"TEST / RECORD"とマークされたスイッチがあります。スイッチが"TEST"に設定されていることを確認してください。入口電磁弁を開くには"エアサプライ"とマークされたボタンをクリックします。
- ガス圧力レギュレータを使用して、1 PSIで圧縮空気とチャンバーを加圧する。チャンバー内の圧力は、チャンバの後端-プレート上にあるデジタル圧力計を使用して読み取ることができます。圧力が平衡化されていると、信号増幅器から電圧の読み値を記録。 2、3、4、5 PSIについて、この手順を繰り返します。
- 圧力対電圧の検量線を作成します。圧力はPSIからmmHgに変換する必要があります。グラフから方程式は、LabVIEWプログラムのコードに配置することができます
- 圧力室からアルミフロントプレートを取り外し、70％エタノールでチャンバーをスプレー。残留エタノールガスが放散できるように、最低10分間放置。
- 室にリーフレットのサンプルを含む6ウェルプレートを置き、フロントエンドプレートを交換してください。シールは手で4つのねじ山付きロッド（エンドプレートの各隅にある）上にあるナットを締めて、気密であることを確認してください。 37℃インキュベーターに圧力室を配置。圧力室の概略図を図2に示します。
- インタフェースは、圧縮空気の入力と出力の間にシステムサイクル時間を提供するためにユーザに促します。これらは、0.6秒に設定され、1Hzの周波数で、それぞれ、収縮期血圧および拡張期の条件を模倣するために0.4秒してください。また、ユーザーは、データファイルのパスを入力する必要があります。
- LabVIEWでは、"RECORD"のトグル"TEST / RECORD"を実行して切り替える]をクリックします。
- 圧力は、LabVIEWのインターフェイス上でグラフを用いて所望のレベルにあることを確認してください。圧力は、ガス圧力調整器を使用して調整することができます。
- 時間の希望の長さのためのプログラムを実行します。
- 実験が完了すると、は、LabVIEW上でストップボタンをクリックして空気の供給をオフにし、圧力室に排気バルブを開く。
- チャンバーからフロントエンドプレートを取り外し、サンプルを含む6ウェルプレートを取得。サンプルは遺伝子発現、タンパク質発現、組織学、機械的特性等について分析することができる
3。代表的な結果：
圧力システムは正常血圧の下で観察された最大圧較圧力をシミュレートすることができる、I期およびII期血圧の条件を上演。しかし、圧力は、生体内で実質的にゼロである収縮期圧較差を、模倣することができませんでした。周波数は0.6秒と0.4秒の排気時間の空気入口の時間で、1Hzで維持されます。システムから得られた正常と高い圧力の条件の代表的な圧力波形を図3に見ることができます。
図1：LabVIEWのインターフェースのスクリーンショット。
図2：圧力室の圧力室A.等角図の模式図、圧力室のB.サイドビュー。圧力室のC.上から見た図。
図3：（A）正常血圧、（B）私は高血圧ステージ、および（C）ステージII高血圧の条件での圧力室内の圧力のシミュレーションのグラフ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
圧力システムが正常に拡張期圧較圧力の代表だった周期圧力に大動脈弁尖を露呈した。圧力は40 mmHgにドロップされたとしてしかし、それは、収縮期圧較圧力を模倣することができませんでした。圧較圧力は上行大動脈の圧力と左心室の間の差である。拡張期の間に、バルブが閉じているときに、圧力差は、正常血圧の条件と90 mmHgの下で80mmHgされており、I期およびII期の高血圧は、それぞれの段階で100mmHg。収縮期に、バルブが開いているときに、左心室と大動脈との間の圧力差はゼロです。大動脈弁疾患で発生する細胞の変化は、高い拡張期血圧と関連すると考えられているので、圧力がゼロに落ちていないという事実は、大きな懸念とならない場合があります。これは、それが生物学的反応の原動力である圧力の大きさではなく、圧力の振幅であるという仮定に基づいています。 100 mmHgのから0 mmHgの圧力を減らすことは1.20を必要と± 0.04s、20圧力サイクルのデータ解析から報告された。時間の量は大動脈弁が閉じているが、心周期の約2 / 3であるため、圧力室への空気の流入が開いて、生理的条件下で経験した開閉弁の同じバランスを作成するには2.4s必要になります。その結果、0.28 Hzの周波数は、収縮期血圧と大動脈弁のmechanobiologyで拡張期圧較圧レベルの両方の効果をテストするために使用されます。しかし、収縮期および拡張期圧較の圧力の両方を1 Hz、真空ポンプとリザーバーの生理的な周波数でシミュレートする場合は排気電磁弁に取り付けることができます。真空ポンプは、排気弁が開いたときにその圧力の一定量を除去するように設定することができる、完全に設定圧力のレベルからの圧力を軽減するために必要な空気量は、真空リザーバーに引き込まれる。圧力の除去は、収縮期圧較圧と同義0 mmHgの環境を作成します。逆に、排気弁が閉じると、真空はもはや室には影響しませんし、圧力が加圧された空気を介して増加できるようになります。近い生理的条件を模倣するために真空ポンプを使用するだけでなく、より大きな直径を持つ排気バルブは、より迅速にバイオリアクター内の圧力を削除するために使用できます。現在、3 / 8直径当たり28.0ガロンの流量を持っている"直径排気電磁弁は、毎分3.3ガロン（60℃1のF、比重）の流量を持っている2は、排気バルブ、一方"分。大きい径の電磁弁は真空ポンプを使用するよりも費用効率が向上、しかし、それは生理的範囲内ではゼロには完全に圧力を落とすことができない場合があります、したがって、さらなる調査が必要です。また、同時に開いているのと同じ制御回路によって引き起こされるいくつかの電磁弁は、"並列処理"することにより、ガスの流出を追加することができます。
システムは、連続的に圧縮空気を社内で使用して動作することができます。これまでの研究では、遺伝子およびタンパク質発現の急性変化が二時間16、17内に発生する可能性があることが示されている。しかし、この期間は、機械的ストレスの結果として一時的な遺伝子/タンパク質発現や細胞の表現型の変化を研究するために十分ではない可能性があります。圧縮空気を使用しての欠点は、ガスが培地のpHを制御するために重要である5％CO 2を 、含まれていないということです。これは、培地にHEPES緩衝液を添加することにより克服することができます。また、細胞は代謝老廃物としてCO 2を生成する 。組織からのCO 2の分泌も、基本になる培地を防ぐことができます。
さまざまな圧力で大動脈弁のテストに加えて、それは同様に周波数を変化させる効果を研究するのが賢明かもしれません。例えば、心拍数の変化の影響の間に、前、および手術後のバルブ内でのタンパク質発現の変化を解明することができます。術後の不整脈は、患者の18から21の20％までに起こる。このシステムで使用するLabVIEWプログラムは、ユーザーが入力時の空気の長さを選択することができますし、チャンバーを残しますので、サイクルの周波数を簡単に調整することができます。装置は、チャンバーからの圧力を排気するために必要な時間のために1.5Hzの最大周波数（90bpm）が可能になります。図3に示すように、排気バルブの活性化後の最初の0.2秒に発生した主要な圧力の減少は、その後徐々に排気の残り0.2秒のための残圧を避けた。排気の初期0.2秒の平均圧力損失は45.8でした± 20圧力サイクルにわたって測定0.34mmHg、。ステージII高血圧の条件をテストする唯一の少なくとも60から100 mmHgの間のサイクル圧力を必要とすることを考えると、1.5 Hzの周波数は、排気のために0.22sを可能にする、これは十分なティムです。圧力40 mmHgに低下する電子。真空ポンプは排気バルブに接続されている場合、それは圧力でより速く低下を促進する可能性があり、より高い周波数のテストをできるようになります。圧力調整器は空気と排気バルブの遅流入が原子炉内の圧力を削除するための十分な時間を持っているという可能性がありますので、バイオリアクターの最小周波数は、しかし、限定されるものではない。
結論では、無菌培養系は、ブタの大動脈心臓弁のmechanobiologyのex vivoでの研究をできるように構成されています。バイオリアクター内の圧力は、生理学的および病理学的条件のために拡張期圧較圧レベルとの間で循環。システム要件を満たすために、バイオリアクターは、コンパクトであり、したがって、37℃で組織の温度を維持するために加湿インキュベーター内に含まれる可能性℃のさらに、圧力の大きさと周波数が条件の広い範囲を調べることができるように、独立して制御された。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、原稿を準備するための支援システムとValtresaのマイルズの設計と製造とその支援のためのシャッドSchipkeとダニエルチェサーに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
