Summary
En cyklisk tryck bioreaktor kan utsätta vävnaden hjärtklaff till fysiologiska och patologiska tryckförhållanden har konstruerats. Ett LabVIEW programmet tillåter användare att kontrollera trycket storlek, amplitud och frekvens. Den här enheten kan användas för att studera mechanobiology av hjärtklaff vävnad eller isolerade celler.
Abstract
Aortaklaffen, som ligger mellan vänster kammare och stora kroppspulsådern, möjliggör enkelriktad blodflödet och förhindrar backflöde i kammaren. Aortaklaffen flygblad består av interstitiella celler som är upphängd i ett extracellulärt matrix (ECM) och kantas av en endotelceller monolager. Ventilen tål en hård, dynamisk miljö och ständigt utsatt för skjuvning, böjning, spänning, och kompression. Forskning har visat calcific lesioner i sjuka ventiler uppstå i områden med hög mekanisk belastning som en följd av endotelceller störning eller interstitiell matris skador 1-3. Därför är det inte förvånande att epidemiologiska studier har visat högt blodtryck att vara en ledande riskfaktor för uppkomsten av aortaklaffen sjukdom 4.
Det enda behandlingsalternativ finns för närvarande för ventil sjukdom är kirurgiskt byte av sjuka ventil med en bioprosthetic eller mekanisk ventil 5. Förbättrad förståelse av ventil biologi som svar på fysiska påfrestningar skulle hjälpa klarlägga mekanismerna av ventil patogenes. I sin tur kan detta bidra till utvecklingen av icke-invasiv behandling såsom läkemedel intervention eller prevention. Flera bioreaktorer har tidigare utvecklat för att studera mechanobiology av inhemska eller konstruerad hjärtklaffar 6-9. Pulserande bioreaktorer har också utvecklats för att studera en rad olika vävnader inklusive brosk 10, ben 11 och urinblåsa 12. Syftet med detta arbete var att utveckla en cyklisk press system som kan användas för att belysa den biologiska respons aortaklaffen flygblad till ökat tryck belastning.
Systemet bestod av en akryl kammare där du vill placera prover och producera cykliska trycket, viton membran magnetventiler för att styra tidpunkten för trycket cykel, och en dator för att styra elektriska apparater. Trycket var övervakas av en tryckgivare, och signalen var villkorat med ett balsam lastcell. Ett LabVIEW program regleras trycket med hjälp av en analog enhet för att pumpa luft i systemet vid en lämplig takt. Systemet härmade den dynamiska transvalvular trycknivåer i samband med aortaklaffen, en sågtandade våg producerat en gradvis ökning av trycket, typiskt för transvalvular tryckgradienten som finns över ventilen under diastole, följt av en kraftig tryckfall skildrar ventil öppning i systole. I LabVIEW programmet får användaren att styra omfattningen och frekvensen av cykliska trycket. Systemet kunde föremål vävnadsprover till fysiologiska och patologiska tryck. Den här enheten kan användas för att öka vår förståelse för hur hjärtklaffar reagera på förändringar i den lokala mekaniska miljö.
Protocol
1. Tissue Harvest och preparering
- Aorta ventiler bör samlas in från vuxna svin väger inte mer än £ 120 omedelbart efter döden.
- Tvätta ventiler två gånger med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och transport till laboratoriet på is.
- Alla efterföljande steg skall utföras under sterila förhållanden.
- Se till att flygblad inte visar några tecken på degeneration, sönder eller förkalkning. Ta ut flygblad från aortaroten genom att klippa 1 / 3 av avståndet från annulus.
- Placera flygblad i enskilda brunnar i en sex brunnar och inkubera över natten med 3ml Dulbecco s Modified Eagle Medium kompletterad med 1% anti-biotic/anti-mycotic lösning och 10% fetalt bovint serum vid 37 ° C och 5% CO 2.
- Som ett alternativ, isolerade celler kan seedas in i sex brunnar odlingsplattor och används i tryck-enheten. Isolering av ventil endotelceller och interstitiella celler kan utföras som tidigare beskrivits 13, 14.
2. Tryck Studier
- En skräddarsydd trycket systemet har utformats för att studera mechanobiological Effekterna av cyklisk press på aortaklaffen vävnad 15.
- Logga in på datorn och öppna LabVIEW-programmet (Figur 1).
- Kalibrering:
- Innan experiment, bör systemet vara rätt kalibrerad.
- Anslut strömförsörjningen till kretskortet. Detta ger ström till magnetventiler som styr flödet av luft in och ut ur kammaren.
- Se till att tryckluften är ansluten till systemet och öppna lufttillförseln till full hastighet.
- Sätt på signalförstärkare. Se till att spänningen läsning är 0,00. Justera vid behov
- I LabVIEW gränssnitt har en brytare märkt "TEST / RECORD". Se till att omkopplaren är inställd på "TEST". Klicka på knappen märkt "Air Supply" för att öppna ventilen inlopp solenoiden.
- Använda gasen tryckregulator, trycksätta kammaren med tryckluft vid 1 PSI. Trycket i kammaren kan läsas med hjälp av digitala tryckmätaren placerad på bakre-plattan i kammaren. När trycket har ekvilibrerats, spela in spänningen läsning från signalförstärkare. Upprepa för 2, 3, 4 och 5 PSI.
- Konstruera en kalibreringskurva trycket vs spänning. Trycket bör omvandlas från PSI till mmHg. Ekvationen från diagrammet kan placeras in i koden för LabVIEW programmet
- Avlägsna plattan framsida i aluminium från tryckkammaren och spraya kammaren med 70% etanol. Låt stå i minst 10 minuter så att kvarvarande etanol rök att försvinna.
- Placera sex brunnar som innehåller broschyren prover in i kammaren och ersätter den främre gavel. Se till att tätningen är tät genom att dra åt muttrarna sitter på fyra gängstänger (placerad i varje hörn av ändplattan) för hand. Placera tryckkammaren i 37 ° C inkubator. En schematisk bild av tryckkammare visas i figur 2.
- Gränssnittet kommer att uppmana användaren att tillhandahålla den tid systemet cykler mellan tryckluft ingång och utgång. Dessa bör sättas till 0.6s och 0.4s att efterlikna diastoliskt och systoliskt förhållanden respektive vid en frekvens av 1 Hz. Användaren ska också ange en datafil väg.
- I LabVIEW, klicka på Kör och slå på "TEST / RECORD" växla till "Record".
- Se till att trycket är på önskad nivå med hjälp av grafen på LabVIEW gränssnitt. Trycket kan justeras med regulatorn gastrycket.
- Kör programmet för önskad tid.
- När experimentet är klar klickar du på stoppknappen på LabVIEW, stäng av lufttillförseln och öppna avgasventil på tryckkammaren.
- Ta bort den främre gavel från kammaren och hämta sex brunnar som innehåller prov. Prover kan nu analyseras för genuttryck, proteinuttryck, histologi, mekaniska egenskaper etc.
3. Representativa resultat:
Trycket är som kan simulera maximal transvalvular trycket observerade under normotensiva steg I och steg II hypertensiva förhållanden. Dock var trycket inte kan efterlikna lutningen systoliska trycket, som i grunden är noll in vivo. Frekvens hålls på 1 Hz, med ett luftintag tid 0.6s och ett avgassystem tid 0.4s. Representant trycket vågformer av normalt och förhöjt tryck villkor som erhålls från systemet kan ses i figur 3.
Figur 1: Skärmdump av LabVIEW gränssnitt.
Figur 2: Schematisk bild av tryckkammare A. Isometrisk avbildning av tryckkammare, B. Sidovy av tryckkammare;C. Top bild av tryckkammare.
Figur 3: Diagram av tryck simulering inom tryckkammaren vid (A) normotensiva (B) steg I hypertensiva, och (C) steg II hypertensiva förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trycket systemet utsätts framgångsrikt aortaklaffen broschyrer till cykliska påfrestningar som var representativa för diastoliskt transvalvular tryck. Det var dock inte kunnat efterlikna systoliskt transvalvular tryck, eftersom trycket bara sjunkit till 40 mmHg. Transvalvular trycket är skillnaden mellan trycket i aorta ascendens och vänster kammare. Under diastole, när ventilen är stängd, är tryckskillnaden 80mmHg i normotensiva villkor och 90 mmHg och 100 mmHg i fas I och fas II högt blodtryck, respektive. Under systole, när ventilen är öppen, är tryckskillnaden mellan vänster kammare och aorta ascendens noll. Det cellulära förändringar som sker i aortaklaffen sjukdomen tros vara associerade med högt diastoliskt tryck, och därför kan det faktum att trycket inte faller till noll inte vara ett stort problem. Detta bygger på antagandet att det är tryck storlek och inte trycket amplitud som är den drivande kraften bakom biologiska reaktioner. Att minska trycket från 100 mmHg till 0 mmHg kräver 1,20 ± 0,04 s, rapporterade från analys av data från 20 tryckcykler. Eftersom den tid aortaklaffen är stängd är ca 2 / 3 av hjärtats cykeln skulle tillströmningen av luft i tryckkammaren kräver 2.4s för att skapa samma balans av ventil öppnar och stänger erfarenhet av fysiologiska förhållanden. Som ett resultat skulle en frekvens på 0,28 Hz användas för att testa effekterna av både systoliskt och diastoliskt transvalvular nivåer press på aortaklaffen mechanobiology. Däremot kan om både systoliskt och diastoliskt transvalvular trycket ska simuleras på ett fysiologiskt frekvens av 1 Hz, en vakuumpump och reservoar monteras på avgasröret magnetventilen. Vakuumpumpen kan välja att ta bort ett fast belopp på trycket så när avgasventilen öppnar, skulle den mängd luft som krävs för att helt minska trycket från den inställda trycknivå dras in i vakuum reservoaren. Borttagandet av trycket skulle skapa en 0 mmHg miljö, synonymt med systoliskt transvalvular tryck. Omvänt, när avgasventilen stänger kommer vakuum inte längre påverkar kammaren och gör det möjligt för trycket att öka via tryckluft. Förutom att använda en vakuumpump för att närmare efterlikna fysiologiska förhållanden kan en avgasventil med större diameter användas för att släppa trycket i bioreaktor snabbare. För närvarande "har diameter avgaser magnetventil en flödeshastighet på 3,3 liter per minut (vid 60 ° C, specifik vikt av 1), medan en avgasventil med en 2" den 3 / 8 diameter har ett flöde på 28,0 liter per minut. En större diameter magnetventil är mer kostnadseffektiv än att använda en vakuumpump, men det kanske inte kan släppa trycket helt till noll inom fysiologiska räckvidd och bör därför utredas vidare. Alternativt kan flera magnetventiler utlösas av samma kontroll krets som öppna samtidigt läggas till, därmed "parallell-processing" gasen utflöde.
Systemet kan köras kontinuerligt med egen tryckluft. Tidigare studier har visat att akuta förändringar i gen-och proteinuttryck kan ske inom två timmar 16, 17. Detta kan emellertid varaktigheten inte räcker att studera övergående gen / protein uttryck eller förändringar av cellens fenotyp som en följd av mekanisk stress. Nackdelen med att använda tryckluft är att gasen inte innehåller 5% CO 2, vilket är viktigt för att kontrollera pH i substratet. Detta problem kan lösas genom att lägga Hepes bufferten till mediet. Även celler producerar CO 2 som en metabolisk avfallsprodukt. Utsöndring av CO 2 från vävnaden kommer också förhindra att mediet blir grundläggande.
Förutom att testa aorta ventiler vid olika tryck, kan det vara klokt att studera effekterna av olika frekvenser också. Till exempel kan effekterna av förändringar i hjärtfrekvens före, under och efter operation belysa förändringar i proteinuttryck i ventilen. Postoperativ arytmi förekommer i upp till 20% av patienterna 18-21. I LabVIEW program som används för detta system gör att användaren kan välja hur lång tid luft kommer in och lämnar kammaren, och därför kan frekvensen av cykeln enkelt justeras. Enheten tillåter en maximal frekvens av 1,5 Hz (90bpm) på grund av den tid som krävs för att uttömma trycket från kammaren. Som framgår av Figur 3, en större tryck minskningen skedde under de första 0,2 s efter avgasventil aktivering, sedan successivt minskat till resttryck för resterande 0,2 s av avgaser. Den genomsnittliga tryckfallet i den inledande 0,2 s av avgaser var 45,8 ± 0.34mmHg, mätt över 20 tryckcykler. Med tanke på att testa steg II hypertensiva villkor kräver bara cykla trycket mellan åtminstone 6-10 mmHg, gör en frekvens av 1,5 Hz 0.22s för avgaser, vilket är gott Time för att släppa 40 mmHg i tryck. Om en vakuumpump är ansluten till avgasventil, kan det underlätta en snabbare nedgång i tryck och skulle ge högre frekvens testning. Den lägsta frekvensen av bioreaktor är inte begränsad, men eftersom tryckregulatorn kan tillåta långsam tillströmning av luft och avgasventil skulle ha tillräckligt med tid för att släppa trycket i reaktorn.
Sammanfattningsvis har en steril kultur-system byggts så att ex vivo studier av svin aorta hjärtklaff mechanobiology. Trycket i bioreaktor cyklade mellan diastoliskt transvalvular trycknivåer för fysiologiska och patologiska tillstånd. För att möta systemkraven, var bioreaktor kompakt och kan därför vara innesluten i en fuktig kuvös för att hålla vävnader temperaturen vid 37 ° C. Dessutom var trycket omfattning och frekvens regleras oberoende, vilket gör att en rad villkor som ska studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för att Shad Schipke och Daniel Chesser för deras hjälp med utformning och tillverkning av systemet och Valtresa Myles för hjälp med att förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
