Summary
Un bioréacteur pression cyclique capable de soumettre des tissus de valves cardiaques à des conditions de pression physiologique et pathologique a été conçu. Un programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l'ampleur de pression, l'amplitude et la fréquence. Ce dispositif peut être utilisé pour étudier la mécanobiologie des tissus de valves cardiaques ou des cellules isolées.
Abstract
La valve aortique, situé entre le ventricule gauche et l'aorte, permet la circulation sanguine unidirectionnelle, en prévenant le refoulement dans le ventricule. Des tracts de la valve aortique sont composés de cellules interstitielles en suspension dans une matrice extracellulaire (MEC) et sont bordées d'une monocouche de cellules endothéliales. La vanne résiste à un environnement difficile et dynamique et est constamment exposée à de cisaillement, de flexion, la tension et de compression. La recherche a montré des lésions calcifiées dans les valves malades se produisent dans les zones de fortes contraintes mécaniques en raison de perturbations ou dommages endothéliales matrice interstitielle 1-3. Par conséquent, il n'est pas surprenant que les études épidémiologiques ont montré une pression artérielle élevée est un facteur de risque important dans l'apparition de la maladie de valve aortique 4.
La seule option de traitement actuellement disponibles pour la maladie de valve est le remplacement chirurgical de la valve malade par une valve mécanique ou bioprothèse 5. Une meilleure compréhension de la biologie de soupape en réponse à des stress physiques aiderait élucider les mécanismes de la pathogenèse de la vanne. En retour, cela pourrait aider dans le développement de thérapies non invasives telles que l'intervention pharmaceutique ou de prévention. Bioréacteurs Plusieurs ont déjà été développés pour étudier la mécanobiologie des valves cardiaques natives ou conçu 6-9. Bioréacteurs pulsatile ont également été développées pour étudier une gamme de tissus, y compris le cartilage 10, 11 os et de la vessie 12. Le but de ce travail était de développer un système de pression cyclique qui pourrait être utilisée pour élucider la réponse biologique de tracts de la valve aortique à des charges de pression accrue.
Le système se composait d'une chambre d'acrylique dans lequel placer des échantillons et de produire une pression cyclique, vannes à membrane viton électrovannes pour contrôler la synchronisation du cycle de pression, et un ordinateur pour contrôler des appareils électriques. La pression a été contrôlée à l'aide d'un transducteur de pression, et le signal a été conditionné à l'aide d'un conditionneur cellule de charge. Un programme LabVIEW réglementées utilisant la pression d'un périphérique analogique à la pompe à air comprimé dans le système au taux approprié. Le système a imité les niveaux dynamiques de pression transvalvulaire associés à la valve aortique, une vague en dents de scie produit une augmentation progressive de la pression, typique du gradient de pression transvalvulaire qui est présent à travers la vanne pendant la diastole, suivie d'une forte chute de pression représentant ouverture de la vanne de systole. Le programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l'ampleur et la fréquence de la pression cyclique. Le système a été en mesure de soumettre des échantillons de tissus à des conditions de pression physiologique et pathologique. Ce dispositif peut être utilisé pour accroître notre compréhension de la façon dont les valves cardiaques de réagir aux changements dans l'environnement local mécanique.
Protocol
1. Récolte et préparation des tissus
- Valves aortiques doivent être prélevés sur des porcs adultes pesant pas plus de £ 120 immédiatement après la mort.
- Lavez les vannes à deux reprises avec une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS) et le transport au laboratoire sur la glace.
- Toutes les étapes suivantes devraient être effectuées dans des conditions stériles.
- Assurez-vous que des tracts ne montrent aucun signe de dégénérescence, déchirure ou de calcification. Retirer des tracts de la racine aortique en coupant 1 / 3 de la distance de l'anneau.
- Placez des dépliants dans les puits individuels d'une plaque de six puits et incuber pendant la nuit avec 3ml de Dulbecco Modified Eagle Médium complété avec une solution anti-biotic/anti-mycotic 1% et 10% de sérum fœtal bovin à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Comme alternative, les cellules isolées peuvent être ensemencées dans des plaques de culture à six puits et utilisée dans le dispositif de pression. L'isolement des cellules endothéliales et les cellules de soupape interstitielle peut être effectuée comme décrit précédemment 13, 14.
2. Les études de pression
- Un système de pression faits sur mesure a été conçu pour étudier les effets de la pression cyclique mécanobiologique sur le tissu de la valve aortique 15.
- Connectez-vous à l'ordinateur et ouvrez le programme LabVIEW (Figure 1).
- Calibrage:
- Avant l'expérimentation, le système doit être correctement étalonné.
- Branchez l'alimentation sur le circuit. Ceci fournit la puissance aux électrovannes qui contrôlent le flux d'air entrant et sortant de la chambre.
- Assurez-vous que l'air comprimé est connecté au système et ouvrir l'alimentation en air à la vitesse plein.
- Allumez l'amplificateur de signal. Assurez-vous que la lecture de tension est de 0,00. Ajustez si nécessaire
- L'interface LabVIEW a un commutateur marqué «TEST / RECORD". Assurez-vous que le commutateur est réglé sur "TEST". Cliquez sur le bouton marqué "Air Supply" pour ouvrir l'électrovanne d'admission.
- En utilisant le régulateur de pression de gaz, sous pression de la chambre à air comprimé à 1 PSI. La pression dans la chambre peut être lu en utilisant le manomètre numérique situé à l'arrière plaque d'extrémité de la chambre. Une fois que la pression a équilibré, d'enregistrer la lecture de tension de l'amplificateur de signal. Répétez l'opération pour PSI 2, 3, 4 et 5.
- Construire une courbe d'étalonnage de pression fonction de la tension. La pression doit être converti à partir PSI mmHg. L'équation à partir du graphique peuvent être placés dans le code du programme LabVIEW
- Retirez la plaque avant en aluminium de la chambre de pression et de pulvérisation de la chambre avec 70% d'éthanol. Laisser un minimum de 10 minutes pour permettre à des vapeurs d'éthanol résiduel se dissipe.
- Placer la plaque de six puits contenant les échantillons dépliant dans la chambre et de remplacer la plaque frontale. S'assurer que le joint est étanche par serrage des écrous situés sur les quatre tiges filetées (situés à chaque coin de la plaque d'extrémité) à la main. Placez la chambre de pression dans l'incubateur 37 ° C. Un diagramme schématique de la chambre de pression est montré dans la figure 2.
- L'interface invite l'utilisateur à fournir la quantité de temps entre les cycles du système d'air comprimé d'entrée et de sortie. Ceux-ci devraient être mis à 0.6s et 0.4s pour imiter les conditions systolique et diastolique, respectivement, à une fréquence de 1Hz. L'utilisateur doit également entrer un chemin vers le fichier de données.
- Dans LabVIEW, cliquez sur Exécuter et passer le «TEST / RECORD" toggle pour "enregistrer".
- Assurez-vous que la pression est au niveau souhaité à l'aide du graphique de l'interface LabVIEW. La pression peut être ajustée en utilisant le régulateur de pression de gaz.
- Exécutez le programme pour la longueur de temps désirée.
- Une fois l'expérience terminée, cliquez sur le bouton d'arrêt sur LabVIEW, éteignez l'alimentation en air et d'ouvrir la soupape d'échappement sur la chambre de pression.
- Retirer la plaque d'extrémité avant de la chambre et récupérer des échantillons de plaque de six puits contenant. Les échantillons peuvent maintenant être analysées pour l'expression des gènes, l'expression des protéines, l'histologie, les propriétés mécaniques etc
3. Les résultats représentatifs:
Le système de pression est capable de simuler les pressions maximales observées sous transvalvulaire normotendus, de phase I et II des conditions hypertendus. Cependant, la pression n'a pas été capable d'imiter le gradient de pression systolique, qui est essentiellement nul in vivo. Fréquence est maintenue à 1Hz, avec un temps d'entrée d'air de 0,6 s et un temps d'échappement de 0,4 s. Courbes de pression représentant des conditions de pression normales et élevées obtenues par le système peut être vu dans la figure 3.
Figure 1: Capture d'écran de l'interface LabVIEW.
Figure 2: Schéma de la vue la pression chambre A. isométrique de la chambre de pression; B. Vue latérale de la chambre de pression;C. Vue du haut de la chambre de pression.
Figure 3: Graphe de simulation de pression dans la chambre de pression en (A) normotendus, (B) Stade I hypertendus, et (C) Phase II des conditions hypertendus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le système de pression avec succès exposés tracts valve aortique à des pressions cycliques qui sont représentatifs de la pression diastolique transvalvulaire. Toutefois, il n'a pas été capable d'imiter la pression systolique transvalvulaire, comme la seule pression a chuté à 40 mmHg. Pression transvalvulaire est la différence entre la pression dans l'aorte ascendante et le ventricule gauche. Pendant la diastole, lorsque le clapet est fermé, la différence de pression est 80mmHg dans des conditions normotendus et 90 mmHg et 100 mmHg en phase I et II hypertension, respectivement. Pendant la systole, quand la valve est ouverte, la différence de pression entre le ventricule gauche et l'aorte ascendante est de zéro. Les changements cellulaires qui se produisent dans la maladie de la valve aortique sont censés être associés à la pression diastolique, par conséquent, le fait de la pression ne tombe pas à zéro ne peut pas être une préoccupation majeure. Ceci est basé sur l'hypothèse que c'est l'ampleur de pression et l'amplitude de pression n'est pas qui est la force motrice derrière les réponses biologiques. Réduire la pression de 100 mmHg à 0 mmHg ± 0,04 1,20 nécessite, signalés par l'analyse de données de 20 cycles de pression. Depuis le temps que la valve aortique est fermée est environ 2 / 3 du cycle cardiaque, l'afflux d'air dans la chambre de pression, il faudrait 2.4s pour créer l'équilibre même de l'ouverture de la vanne et la fermeture expérimenté dans des conditions physiologiques. En conséquence, une fréquence de 0,28 Hz serait utilisé pour tester les effets des deux systolique et diastolique des niveaux de pression transvalvulaire sur mécanobiologie de la valve aortique. Cependant, si la fois systolique et diastolique de pression transvalvulaire doivent être simulées à une fréquence de 1 Hz physiologiques, une pompe à vide et le réservoir peut être monté à l'électrovanne d'échappement. La pompe à vide peut être réglée pour supprimer un montant fixe de la pression alors quand la soupape d'échappement s'ouvre, la quantité d'air nécessaire pour réduire complètement la pression du niveau de pression de tarage serait aspiré dans le réservoir vide. La suppression de la pression serait de créer un environnement de 0 mmHg, synonyme de la pression systolique transvalvulaire. Inversement, lorsque la soupape d'échappement se ferme, le vide ne sera plus influent de la chambre et permettrait d'augmenter la pression par l'intermédiaire de l'air sous pression. Outre l'aide d'une pompe à vide pour rapprocher imitent les conditions physiologiques, une soupape d'échappement de plus grand diamètre peut être utilisé pour baisser la pression dans le bioréacteur plus rapidement. Actuellement, les 3 / 8 "de diamètre électrovanne d'échappement a un débit de 3,3 gallons par minute (à 60 ° F, la densité de 1), tandis que, une soupape d'échappement avec un diamètre de 2" a un débit de 28,0 litres par minute. Une valve solénoïde plus grand diamètre est plus rentable que d'utiliser une pompe à vide, mais il peut ne pas être en mesure de chute de la pression tout à zéro dans la plage physiologique et devrait donc être étudiée davantage. Alternativement, électrovannes de plusieurs déclenchée par le même circuit de commande qui s'ouvrent simultanément pourrait être ajoutée, ce qui "traitement parallèle" la sortie des gaz.
Le système pourrait être exploité en continu en utilisant en interne d'air comprimé. Des études antérieures ont montré que des changements aigus dans l'expression génique et protéique peut se produire dans les deux heures 16, 17. Toutefois, cette durée peut ne pas être suffisante pour étudier transitoires gène / protéine d'expression ou de changements dans phénotype cellulaire en raison de contraintes mécaniques. L'inconvénient d'utiliser l'air comprimé est que le gaz ne contient 5% de CO 2, ce qui est important pour contrôler le pH du milieu de culture. Cela peut être surmonté par addition de tampon HEPES dans le milieu. En outre, les cellules produisent du CO 2 comme un produit des déchets métaboliques. La sécrétion de CO 2 à partir des tissus permettra également d'éviter le milieu devenant de base.
En plus de tester valves aortiques à des pressions diverses, il peut être prudent d'étudier les effets de la variation des fréquences aussi bien. Par exemple, les effets des changements de la fréquence cardiaque avant, pendant et après la chirurgie pourrait permettre d'élucider des changements dans l'expression des protéines dans la vanne. Arythmies postopératoires surviennent chez jusqu'à 20% des patients 18-21. Le programme LabVIEW utilisée pour ce système permet à l'utilisateur de choisir la longueur de l'air du temps entre et sort de la chambre, par conséquent, la fréquence du cycle peuvent être facilement réglés. Le dispositif permet, pour une fréquence maximale de 1,5 Hz (90bpm) en raison de la quantité de temps qu'il faudrait pour épuiser la pression de la chambre. Comme le montre la figure 3, une diminution de la pression importante s'est produite dans la première après 0.2s activation des soupapes d'échappement, puis progressivement diminué à la pression résiduelle pour le restant de 0.2s d'échappement. La chute de pression moyenne dans les 0.2s initiale des gaz d'échappement a été de 45,8 ± 0.34mmHg, mesuré plus de 20 cycles de pression. Étant donné que les essais Phase II hypertendus ne nécessite que des conditions de pression entre le vélo au moins 60-100 mmHg, une fréquence de 1,5 Hz permet 0.22s pour l'échappement, ce qui est amplement Time pour chute de 40 mmHg de la pression. Si une pompe à vide est attachée à la soupape d'échappement, il pourrait faciliter une rapide baisse de pression et de permettre des tests de fréquence supérieure. La fréquence minimale du bioréacteur n'est pas limité, cependant, parce que le régulateur de pression pourrait permettre l'afflux lente de l'air et la soupape d'échappement aurait suffisamment de temps pour faire chuter la pression dans le réacteur.
En conclusion, un système de culture stérile a été construit pour permettre l'étude ex vivo de l'aorte porcine coeur mécanobiologie vanne. La pression au sein du bioréacteur à vélo entre les niveaux de pression diastolique transvalvulaire des conditions physiologiques et pathologiques. Pour répondre aux exigences du système, le bioréacteur était compacte et pouvait donc être contenue dans un incubateur humidifié à maintenir la température des tissus à 37 ° C. Par ailleurs, l'ampleur et la fréquence de pression ont été contrôlés de manière indépendante, permettant à un large éventail de conditions pour être étudiés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à Shad Schipke et Daniel Chesser pour leur aide à la conception et la fabrication du système et Myles Valtresa de l'aide pour la préparation du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
