Summary
在细胞生物学的一个基本任务是定义机制的基础，使真核细胞的细胞器的身份。在这里，我们提出了一个方法，以确定该基因的植物细胞器，利用荧光显微镜和下一代测序工具的形态和功能的完整性负责。
Abstract
本协议描述了拟南芥幼苗的荧光显微镜为基础的筛选，并介绍如何将隐性突变，改变了一个特定的标记分泌途径中的荧光标记的亚细胞分布。 拟南芥是一种强大的生物遗传研究模型，因为它的基因组大小，一代的时间，并节约王国之间的分子机制。作为一种方法来映射替代传统的方法，基于分子标记的突变基因分型阵列是有利的，因为它是相对较快，可能允许在一个非常短的时间框架的几个突变的映射。这种方法允许蛋白质的鉴定，可以影响任何在植物细胞器的完整性。在这里，作为一个例子，我们提出了一个重要的内质网（ER）的完整性的地图基因的屏幕。然而，我们的做法，可以很容易地扩展到其他植物细胞器（例如，见1,2），因此代表了对理解其他亚细胞结构的分子基础的重要一步。
Protocol
1。 EMS处理
拟南芥种子的诱变诱变剂乙基甲烷磺酸盐（EMS），3,4，这将导致基因组的C-T的变化的C / G / A突变5-7使用。
- 权衡0.8Ğ拟南芥种子携带的细胞器荧光标记（特别是，在这项研究中，ssGFPHDEL（信号序列的GFP-HDEL四肽）已作为ER标记）（〜40,000种子）。
- 在50毫升的猎鹰管转移的种子，然后加入25毫升蒸馏水。
- 添加0.2％（V / V）乙基甲烷磺酸盐。
- 16小时孵育关于nutating低速搅拌机。
- 吸液和丢弃到一个瓶含1.0 M氢氧化钠灭活EMS。
- 含种子，靠近猎鹰管加入25毫升水，倒置洗种子的5倍;等到所有的种子纷纷落户，然后吸水和丢弃到1.0米娜俄亥俄州瓶。
- 重复的高达10倍的洗涤步骤。
- 最后一次洗涤后，重新挂起的种子，在少量的水。
- 进行种子消毒，加入25毫升10％的漂白剂，用力摇动30秒。让种子定居的底部，再倒入漂白剂和25毫升无菌水冲洗。倒入无菌水，加入25毫升70％的乙醇。摇管为30秒。让种子定居的底部。倒掉乙醇，25毫升无菌水冲洗。重复两次用无菌水冲洗，然后倒入塑料的Petri菜含有3 MM滤纸上的种子，让引擎盖下干燥。在4°C保存2天。
- 板半，MS phytagel（Murashige和斯库格中期的一半浓度），150毫米的培养皿（〜250-300板种子）的种子。
- 2周的货币供应量M1种子生长板，然后移植到土壤中。
- 收集个别M1植株M2的种子，产生M2的行（1000独立线）。
在本节中，我们描述了与前面所述的8共聚焦荧光显微镜观察幼苗。
- 60从每个M2线的种子成长为7至10天，在塑料培养皿，半质谱phytagel;同一板块也增长了5苗EMS-未处理（对照组）。
- 五到十年子叶安装背面朝着镜头（40X）在显微镜幻灯片和盖玻片包围。
- 每个子叶观察，从皮质到内侧区域的荧光下，任何改变的细胞器标记的亚细胞分布。
- 阳性植株移植到土壤中，其种子的收集和筛选，再次确认在M3代的突变体。
- 移除污染背景突变，通过回交至少三次到野生型的基因组可能合作ntaining所需的细胞器荧光标记。
- 从母株，用细剪刀或镊子删除角果成熟，开放的鲜花。
- 取下芽太小的分生组织。
- 插入一对钳打开一个花蕾，并删除所有花药之间的花瓣和萼片尖端。
- 用一个钳子从父亲的工厂采取一个开放的成熟花和擦上的阉割植物的耻辱的花药。
3。映射
本节描述基本上是如何映射隐性突变，从9 Borevitz修改的协议，这是更快，如果比传统的映射方法10,11。这种方法使用的检测能力在一个单一的检测12多个单一功能多态性（SFPS）的高密度寡核苷酸阵列。使用Affymetrix拟南芥ATH1基因芯片阵列是可能的分析约24,000个基因。楼2个人突变池相比，野生型F 2分离群体在同一采集植物池。然后，突变，在突变型等位基因突变池丰富的地区将被映射，因此在同一地区，野生型池将导致野生型的父母等位基因13丰富。
- 合子突变哥伦比亚（M3）的使用Qiagen公司的DNeasy植物Mini试剂盒提取基因组DNA（3微克）和Illumina的Genome Analyzer的II（GA二）14测序提交。
- 纯合子突变哥伦比亚（M3）兰茨贝格万寿菊杂交产生作图群体。
- 70显示异常的表型和F2植株与野生型的表型相同数量高达100 F2群体进行映射。
- 收集每个植物叶盘使用打孔（0.60毫米）。 “叶盘应收集相同年龄的叶片，以确保有类似的DNA。可处理的样品基因组提取，单独或团体。在这种情况下，它可以收集每个Eppendorf管5-10样本，以便在年底将有更少的Eppendorf管从基因组DNA提取。
- MasterPure植物叶片DNA纯化试剂盒（震中）用于提取基因组DNA。从每个样品中获得的基因组DNA进行了量化了的NanoDrop。
- 从每个样品相同数量的基因组DNA，然后放在一起共有300毫微克（约30μL）植物的DNA，添加60μL的2.5倍随机引物溶液125毫米的Tris-HCl（pH值6.8），12.5毫米氯化镁，25毫米2 - 巯基乙醇，750微克/毫升的寡核苷酸引物（随机八聚体）]（Bioprime套件）和42μL水（终体积为132微升）。
- 在变性的DNA> 95℃，5至10分钟。
- 冰酷。
- 每个denatu红色的DNA加入15μL的10倍[1毫米素-14-dCTP，1毫米，2毫米的dATP dCTP，三磷酸2毫米，2毫米dTTP在10毫米的Tris-HCl（pH值7.5），1毫米乙二胺四乙酸二钠与生物素dCTP] dNTPs浓度混合（Bioprime包），并完成与3μL的Klenow聚合酶（Bioprime包）。
- 在25°C孵育过夜
- 翌日，添加15μL的3个M醋酸钠和400μL的冷100％的乙醇;组合。
- 在-80°C孵育1小时，然后旋转15分钟20,500 XG，除去上清液，用500μL的冷乙醇75％。
- 20500 XG旋转10分钟。
- 在37°C干燥的DNA颗粒为10分钟和100μL水重悬。
- 使用5μL的凝胶上（ 图2）的产量和质量检查。
- 发送95μL标记野生型和突变基因芯片拟南芥ATH1基因阵列杂交反应。
- 阵列扫描和分析获得的。CEL文件使用R软件（ http://www.r-project.oRG /）。
- 安装R软件，然后打开该程序，并粘贴以下字符串：
源（“ http://bioconductor.org/biocLite.R “）
biocLite（）
然后按回车键，这将安 装标准的Bioconductor封装（ http://www.bioconductor.org ）的。 - 在新的文件夹在桌面上，从以下网站（ http://www.naturalvariation.org/methods ）文件下载：
readcel.R
SFP.R
Map.R
ath1V5.RData
ColLerCEL.zip
解压缩文件ColLerCEL.zip应，并粘贴到新文件夹中生成的文件。 - 重命名从你的基因芯片实验获得的数据到wildtype.CEL和mutant.CEL。
- 现在复制的基因芯片数据（wildtype.CEL和mutant.CEL）到您的文件夹。
- 打开R，适用于Mac）：点击“杂项”，然后点击“更改工作目录。” B）邮编：点击“文件”，然后“更改目录”
- 适用于Mac）：选择该文件夹包含的文件。单击“工作区”，“负荷工作区文件”为PC和选择ath1V5.RData，B）：选择包含上述文件的文件夹，单击“文件”，然后选择“载入工作区”，并选择ath1V5.RData。
- 开放readCEL.R使用记事本和整个文本复制到R
- 开放SFP.R使用记事本和整个文本复制到R
- 开放Map.R使用记事本和整个文本复制到R
- 在控制台窗口中，你会看到以下消息：
X染色体限制MB YZ
在这个环节上粘贴在的TAIR搜索基因
3 http://arabidopsis.org/servlets/sv?action=download&chr=x&start=y和结束= Z - 复制并粘贴到您的互联网浏览器的链接。将出现一个窗口，并要求打开或保存文件，你应该选择保存。选择一个文件名和附加扩展名为“。XLS”，然后单击“保存”。
- 打开文件“。XLS”在这里你可以找到您突变的坐标（结果显示在图3表示）。
- 读取组装Illumina的映射区域内确定具体的环境管理体系过渡之间的单核苷酸多态性的突变基因。补充转化突变体与野生型基因，使用标准的程序15（S）。
4。代表结果
图1显示了识别突变体的分泌途径，利用共聚焦显微镜检查所使用的方法。 图2显示了典型的标记基因组DNA阵列杂交准备。在图3中 ，一个典型的后分析基因芯片的ATH1拟南芥基因组阵列得到的数据，提出预期的结果。
图1。拟南芥表达ssGFPHDEL（ER标记）（1）转基因植物种植EMS的治疗（2）产生足够的种子。与EMS处理的种子，然后播种产生（3）货币供应量M1植物。每个货币供应量M1厂代表了不同的线路和种子收集从他们每个人分开。 M2种子被镀上半MS基板（4），然后通过共聚焦显微镜（5）在ER形态缺陷筛选。在筛选中，我们发现，保守的野生型ER形态（6），表明雌激素受体的表型缺陷（7）植物，植物。这些植物生长获得M3代和确认型（8）。 Illumina的测序公司Solexa（一）被用于从M3的植物基因组DNA。同一厂也可用于LER-WT杂交获得的F2作图群体（B）。
图2。Bioprime的随机标记反应（5μL100μL）被装上琼脂糖凝胶1％。巷a是从野生型的F2植株池，车道B从一个突变的F2植株池。 （标记是自NEB 1 kb的DNA阶梯N3232）。
图3。数字代表COL-0突变基因芯片拟南芥ATH1基因组阵列杂交映射的例子。在这个例子中的突变位于1号染色体，由竖线分隔。单杠代表进行检测的阈值。
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Discussion
在这里，我们描述了共聚焦显微镜为基础的筛选为内膜突变体鉴定。这种方法可以很容易地扩展到其他细胞的细胞器，为特定的荧光蛋白标记。基于屏幕的鉴定表明，无论是在目标器官或细胞器，不应该包含标记荧光标记的异常分布的突变。 ，这些突变体分别代表人群中受到损害的器官的能力subcompartimentalize标记或突变体不能正常转运细胞器之间的标记。在筛选中，我们注意到，一些突变表明，在早期发展阶段的表型早发芽后7天，但结果显示，只有在一个更高的发展阶段的表型。虽然这可能是联系在一起的原因很多，其中包括发展依赖突变表达等位基因（S），这表明，植物应研究在不同生长阶段（至少7至14天），以保证不丢弃可能感兴趣的突变。
在此协议中所描述的方法，使我们能够在一个相对较短的时间映射的基因相比，古典映射方法。事实上，收集足够数量的基因芯片阵列所使用的F2群体的个人，需要一个比较经典的精细定位过程所需的F2植株的相对少量的时间。不过，也有应遵守的关键步骤。应选择显示或不显示的表型的F2群体样本进行了仔细以来的除了少数甚至是错误的错误型植物，可以引入错误，最终的结果。这主要是挂钩的事实，用于粗糙映射的F2群体是很小的。出于这个原因，选择植物的企业所得税她显示或不显示的表型应在发芽后的同一天进行的每一次。这是因为，正如我们上面提到的，表型的外观可与增长。另一个重要的一点要考虑的是，仔细看的下一代数据postalignment的程序，给我们的重要信息（如含变种读取的百分比），这是产生。杂合变异的理论价值预计在50％左右，这意味着50％的序列包含的变种，而纯合变异，大约是100％。不幸情况后postalignment可以是从理论价值远，其实含有杂合子变异可以改变读取的百分比从20％到80％，而从60到100％纯合子16。因此，为了不要错过了关键的单核苷酸多态性（SNP）的，重要的是要不要放弃突变百分比小于100％的转口广告的变体。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们承认，化学，地质和生物科学部，办公室基础能源科学，科学办公室，美国能源部（奖DE-FG02-91ER20021）和国家科学基金会（MCB 0948584）（FB）的支持。我们感谢编辑手稿女士卡伦鸟的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethylmethane sulfonate | Sigma-Aldrich | M0880 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-05 | |
| Murashige skoog basal medium w gamborg vitamins | Phyto technolog laboratorie | M404 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169-1Kg | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Master pure plant leaf DNA purification kit | Epicentre Biotechnologies | MPP92100 | |
| Bioprime DNA labeling system | Invitrogen | 18094-011 | |
| Alcohol 200 proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| NaOAc | JT Baker | ||
| Gene chip Arabidopsis ATH1 genome array | Affymetrix | 900385 | |
| Falcon tubes 50 mL | Corning | 430290 | |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | |||
| Filter paper 90mm | Whatman, GE Healthcare | 1001090 | |
| Analytical Balance | Mettler Toledo | n.a | |
| Nutating (wave) shaker | Heidolph | n.a | |
| Centrifuge | Eppendorf | n.a |
References
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