Summary
Her beskriver vi bruk av en selv-montering 3-dimensjonale stillas til kultur menneskelige nevrale stamceller. Vi presenterer en protokoll for å frigjøre cellene fra stillasene for å bli analysert senere for eksempel ved flowcytometri. Denne protokollen kan tilpasses andre celletyper å utføre detaljerte mechanistically studier.
Abstract
Påvirkningen av 3-dimensjonale (3D) stillasene på vekst, spredning og til slutt neuronal differensiering er av stor interesse for å finne nye metoder for celle-baserte og standardiserte terapier i nevrologiske lidelser eller nevrodegenerative sykdommer. 3D strukturer forventes å gi et miljø mye nærmere in vivo situasjon enn 2D kulturer. I forbindelse med regenerativ medisin, har kombinasjonen av biomateriale stillasene med nevrale stamceller og progenitorceller store løftet som et terapeutisk verktøy. 1-5 Kultur systemer som emulerer en tredimensjonal miljø har vist seg å påvirke spredning og differensiering i ulike typer stamceller og stamceller. Heri, er dannelsen og funksjonalisering av 3D-microenviroment viktig å bestemme overlevelse og skjebnen til den innebygde cellene. 6-8 Her har vi brukt PuraMatrix 9,10 (RADA16, PM), et peptid basert hydrogel stillaset,som er godt beskrevet og brukt til å studere påvirkning av et 3D-miljø på ulike celletyper. 7,11-14 PuraMatrix kan tilpasses enkelt og den syntetiske fabrikasjon av nano-fibrene gir en 3D-kultur system av høy pålitelighet, noe som er i tillegg Xeno-free.
Nylig har vi studert påvirkning av PM-konsentrasjonen på dannelsen av stillaset. 13. I denne studien brukes konsentrasjoner av PM hadde en direkte innvirkning på dannelsen av 3D-struktur, som ble demonstrert av atomic force mikroskopi. En etterfølgende analyse av overlevelse og differensiering av hNPCs avslørte en påvirkning av den brukte konsentrasjoner av PM på skjebnen til den innebygde celler. Men analyse av overlevelse eller neuronal differensiering ved hjelp av immunfluorescens teknikk posses noen hindringer. For å få pålitelige data, må man bestemme det totale antall celler innenfor en matrise for å få relative antallet av f.eks. neuronal celler preget av βIII-tubulin. Dette forutsetningene en teknikk for å analysere stillasene i alle tre dimensjoner av en confocal mikroskop eller en tilsvarende teknikk som fluorescens mikroskop kunne ta z-stabler av prøven. Videre er denne typen analyse er svært tidkrevende.
Her vil vi vise en metode for å frigjøre celler fra 3D-stillaser for senere analyser eksempel ved flowcytometri. I denne protokollen humane nevrale stamceller (hNPCs) av ReNcell VM cellelinje (Millipore USA) ble dyrket og differensiert i 3D-stillasene bestående av PuraMatrix (PM) eller PuraMatrix supplert med laminin (PML). I våre hender en PM-konsentrasjon på 0,25% var optimale for dyrking av cellene 13, men konsentrasjonen kan tilpasses andre celletyper. 12. sluppet cellene kan brukes til f.eks immunocytochemical studier og senere analysert ved flowcytometri. Dette hastigheter opp analyse og more over, innhentet data hviler på en bredere base, forbedre påliteligheten av data.
Protocol
1. Del 1: Culture of hNPCs i PuraMatrix
- På forhånd til generering av et stillas med en PuraMatrix konsentrasjon på 0,25% uten laminin man trenger å forberede seg følgende løsninger
- Forbered en løsning som inneholder 20% sukrose og en løsning som inneholder 10% sukrose oppløst i sterilt destillert vann.
- For løsningen en blanding 120 mL av de 20% sukroseløsning med 120 mL destillert vann i en 1,5 ml konisk tube.
- For løsning 2 mix 60 mL av PuraMatrix løsningen med 60 mL 20% sukroseløsning i et 1,5 ml konisk tube.
For en Utarbeidelse av et stillas med en PuraMatrix konsentrasjon på 0,25% supplert med laminin (8 mikrogram per 100 mL Matrix) man trenger å forberede følgende løsninger.
- For løsningen en blanding 72 mL destillert vann med 120 mL 20% sukroseløsning og 48 mL laminin i et 1,5 ml konisk tube.
- For 2-løsning blande 60 mL PuraMatrix løsning med 60 mL av de 20% sukroseløsning i et 1,5 ml konisk tube.
- For embedment av celler i PuraMatrix utarbeide en 4-godt cellekultur plate og legg en sterilisert glass cover slip (diameter 13 mm) i to brønner. Oppbevar plate i ren benk for senere bruk. Glass dekkglass er kun brukt for immunocytochemical studiene. Hvis ingen immunocytochemical stainings er ment, kan trinnet hoppes over.
For å forberede hNPCs for innkapsling i 3D stillasene man må forberede følgende løsninger. Fortynne Benzonase i Trypsin / EDTA-løsning, med en fortynning faktor på 1:10.000. For en Trypsin-Inhibitor/Benzonase løsning mix: DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + 1% HSA + Trypsin-hemmer (0.5mg/ml).
- Løsne cellene ved å legge til 500 mL Trypsin / Benzonase løsningen og inkuberes i 5 min i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Stopp reaksjonen med Trypsin-Inhibitor/Benzonase løsning. Deretter Sentrifuger frittliggende cellene i 5 min ved 3000 x g. Vask cellene med 5 ml 10% sukroseløsning og sentrifuger igjen. Kast supernatanten.
- Suspender cellene i 10% sukroseløsning, bør den endelige celle løsningen inneholder 1x10 6 celler / ml.
Det neste skritt, 01.08 til 01.11, bør gjøres så fort som mulig, på grunn av den lave pH av PuraMatrix løsning, som kan være skadelig for cellene.
- Bland 60 mL av cellesuspensjon med løsning 1.
- Legg til 120 mL av løsning 1, som inneholder cellene, til koniske røret med løsning 2 og bland forsiktig.
- Plasser 100 mL av blandingen umiddelbart på hver dekkglass bodde i 4-brønn plate.
- Legg sakte 200 mL cellekultur medium per brønn, og etter 2-3 minutter ytterligere 200 mL. Dette vil starte selv-montering av matrisen.
- Inkuber calen ved 37 ° C, for 1h i ren benk på en varmeplate eller oppvarmet areal av ren benk. Så langt som mulig ikke flytte plate da dette kan skade montering av matriser.
- Fjerne det meste av mediet, men ikke alle, for å unngå matriser faller tørr, med en 1000 mL pipette. Legg til 500 mL av medium å vaske matriser for 10 min. Til slutt fjerner medium og tilsett 500 mL frisk medium og plassere kulturen plate i en inkubator (37 ° C, 5% CO 2). Siden matriser er følsomme for sjokk platene bør flyttes som mindre som mulig og lagres, om mulig, i en egen inkubator.
- Den her brukt hNPCs var proliferated i 7 dager i 3D-stillasene og differensiering ble initiert av tilbaketrekking av vekstfaktorer 13. Medium ble endret hver 2-3 dag.
2. Del 2: Immunocytochemical farging av hele matriser
- På forhånd til flekker prosedyren man må forberede: ablåsing buffer løsning bestående av 5% normal geit serum og 0,3% av Triton X-100 oppløst i PBS, en 4% Paraformaldehyde løsning basert på 0,1 M PBS og om nødvendig en løsning med 4 ',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid ( DAPI) for en nuclei beising inneholder 100 ng DAPI / ml oppløst i PBS. Prøvene ble montert med en blanding av Mowiol og DABCO.
- Å vaske matriser fjerne medium med en 1000 mL pipette og vask stillaser med PBS gang for 5 minutter.
- For å fikse stillasene fjerne PBS og tilsett 400 mL av Paraformaldehyde (4% i 0,1 M PBS) til hver brønn og inkuber matrisene i 30 minutter ved romtemperatur. Fast Stillaser kan lagres i PBS supplert med 0,02% NaN 3 ved 4 ° C i flere uker opptil flere måneder.
- I forkant av en flekker vaske stillaser med PBS i 5 minutter.
- Inkuber stillasene i blokkering buffer løsning. Blokkering Løsningen ble endret tre ganger hver 2-3 timer og subsequently stillasene ble inkubert i blokkering løsning over natten ved 4 ° C.
- Fjern blokkering bufferløsning og legge det primære antistoffet oppløst i PBS supplert med 1% normal geit serum og inkuber matrisene over natten ved 4 ° C.
- Fjern den primære antistoffet løsningen og vask stillaser 4 ganger i 2 t og deretter over natten ved 4 ° C med PBS.
- Fjern PBS og legger løsningen med den sekundære antistoff, oppløst i PBS supplert med 1% normal geit serum, for 4 timer ved romtemperatur i mørket.
- Vask prøvene med PBS 4-6 ganger i 1 time og deretter over natten ved 4 ° C i mørket.
- For en atomkjerner flekker kan man legge til 400 mL av DAPI løsning for 30 min.
- Slik monterer prøvene man trenger mikroskop lysbilder. Tilsett 50 mL Mowiol / Dabco på objektglass. Fjern dekkglass fra 4-brønn plate og legg dem forsiktig på montering medium.
- Her har vi brukt en Biozero 8000mikroskop (KEYENCE, Tyskland, Karlsruhe) for å oppnå enkle mikrografer og z-stabler. Hver stabel inneholder 30 enkle bilder med en avstand på 1-2 mikrometer. Bruke tilsvarende analysator programvaren uskarphet iboende å fluorescens ble fjernet før full projeksjoner av z-stabler ble produsert.
3. Del 3: Offentliggjøring av hNPCs fra stillaser for flowcytometri analyse
- På forhånd til utgivelsen av celler fra stillasene vaske stillasene med 500 mL HBSS.
- Overfør stillasene ved hjelp av en 1000 mL pipette til en 15 ml konisk rør som inneholder cellekultur medium.
- Å forstyrre stillasene mekanisk resuspender cellen løsningen flere ganger med en 1000 mL pipette og senere sentrifuge løsningen ved 3000 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten med pipette, tilsett 500 mL av Trypsin / Benzonase løsning og cellepelleten suspenderes på nytt flere ganger.
- Inkuber cellene for 5 minved 37 ° C i Trypsin / Benzonase løsning. For å stoppe reaksjonen Tilsett 1 ml Trypsin-inhibitor/Benzonase løsning, og pipette opp og ned flere ganger.
- Sentrifuger cellesuspensjonen 5 min ved 3000 xg, fjern supernatanten og vask cellene med 2 ml HBSS buffer. Gjenta dette trinnet to ganger. Denne prosedyren vil fjerne matrise rusk.
- Pass på cellesuspensjonen løsningen gjennom en celle sil (pore størrelse 70 mikrometer) for å fjerne aggregater og samle cellene i cellekultur medium. Den innhentet celler kan seeded igjen f.eks på dekkglass for funksjonelle studier som patch clamp eller fluometric målinger. Å behandle cellene for flowcytometri, fikse cellene umiddelbart (se 4.1).
Fire. Del 4: Kvantifisering av βIII-tubulin positive celler ved flowcytometri
- Fest utgitt cellene innhentet i steg 3,7 med 1% PFA for 15 minutter ved romtemperatur.
- Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 3000 xg og løsnee supernatanten. Ved behov, kan cellene være forberedt på å bli lagret ved 4 ° C for senere analyse. Derfor Resuspender celler i vaske buffer (PBS supplert med 0,5% BSA og 0,02% Na-azide).
- Å gå videre med forberedelse til flowcytometri, sentrifuger cellen suspensjon 10 min ved 350 xg, kast supernatanten og resuspender cellene i 25 mL av antistoff løsningen. Derfor er det første antistoffet er blandet med saponin buffer ved en konsentrasjon 1:100 f.eks βIII-tubulin. Den saponin buffer består av PBS med et saponin konsentrasjon på 0,5%, en BSA konsentrasjon på 0,5% og en Na-azide konsentrasjon på 0,02%.
- Inkuber cellesuspensjonen med det første antistoffet for 2 t ved romtemperatur på en shaker. Som en negativ kontroll forberede en prøve uten den første antistoffet.
- For det første vasketrinn legge 300 mL saponin buffer direkte til cellene. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 350 x g. For det andre vasketrinn, forkastesupernatanten, tilsett 300 mL buffer og sentrifuger cellen suspensjon i 5 min ved 350 x g.
- Fjern supernatanten og tilsett 25 mL løsning som inneholder den sekundære antistoff (f.eks Alexa 647 Fluor, 1:1000, oppløst i saponin buffer). Inkuber cellene med det sekundære antistoffet 1h ved romtemperatur, i mørket.
- For det første vasketrinn legge 300 mL saponin buffer direkte til cellene. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 350 x g. For det andre vasketrinn, kast supernatanten, tilsett 300 mL buffer og sentrifuger cellen suspensjon i 5 min ved 350 x g.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 500 mL vaskebuffer for flowcytometri analyse.
5. Representant Resultater
Et eksempel på hNPCs dyrket i selv-montering hydrogel Stillaset PuraMatrix er vist i figur 1. Den hNPCs vokse i sfærisk lignende strukturer i umodifisert PM. I denne kulturen tilstandens, celler kan knapt bli gjenkjent i en overføring lys, selv om bunter av prosesser mellom sfærene er synlige (fig 1A). Avhengig av kulturen vilkårene for bruk celletype, kan matrisen endres for eksempel ved å legge laminin. For hNPC cellelinje ReNcell VM (Millipore) laminin er nødvendig for å indusere en vekst mønster med mindre tett tilslag, men en mer homogen fordeling av celler (fig 1B). Uavhengig av modifikasjoner, kan matrisen brukes til å studere f.eks nevronal differensiering. Figur 1C presenterer en farging av hNPCs for neuronal markør βIII-tubulin. I dette eksempelet cellene ble dyrket i 7 dager i matrisen og senere differensiert for 4 dager, der differensiering ble indusert av tilbaketrekking av vekstfaktorer EGF og bFGF. 13 Cell kropper og et tett nettverk av prosesser bygget opp av celler kan være anerkjent lett. Det er imidlertid åpenbart at en kvantifisering av cellen nummeret er tidkrevende, ettersom et stort antallbilder av forskjellige regioner i matrisen må analyseres, for å få en pålitelig data base for en statistisk analyse. I fig 1D kan man se et eksempel på celler løsner fra matrisen og senere platted på dekkglass. Disse cellene kan brukes for funksjonelle studier.
Utgivelsen av cellene fra 3D-stillasene tilbyr muligheten til å analysere ulike parametere som uttrykk for markør proteiner eller overlevelse av cellene ved AnnexinV / PI flekker eller en Tunel analysen. Figur 2 viser et eksempel på en flowcytometri analyse av andelen βIII-tubulin + celler. Den negative kontrollen (celler ikke er merket for βIII-tubulin) er vist i figur 2A. Disse kontrollene brukes til å bestemme porten for senere påvisning av βIII-tubulin + celler (fig 2B). En sammenligning av en manuell telling av celler og en analyse av flowcytometri er vist i figur 2C. Prosentandelen av βIII-tubulin + celler var determstudere aggressiv ved å telle det totale celle nummer (ved hjelp av en kjernefysisk DAPI flekker) og antall βIII-tubulin + celler i fluorescens bildene.
Figur 1. hNPCs dyrket i selv-montering peptid hydrogel PuraMatrix. A) hNPCs innkapslet i PuraMatrix (PM) vokser i sfærisk, tett pakket strukturer, der diameteren på kulene kan være opptil flere hundre mikrometer. I mellom sfærene kan man gjenkjenne bunter av prosesser bygget opp av celler (piler). B) Celler innkapslet i PuraMatrix supplert med laminin (PML) vokser i mindre tette strukturer, mer homogent fordelt. I laminin supplert matrisen kan man gjenkjenne enkeltceller i mindre tette områder (piler), men det er neppe mulig å kvantifisere antall celler. C) hNPCs differensiert for 4 dager i PML uttrykke neuronal markør som βIII-tubulin (grønn). Til evalueringTe prosentandelen av positive celler man har for å bestemme det totale celle nummer av atomkjerner flekker som DAPI (blå). Den microphotograph presenterer hele projeksjon av en z-bunke med bilder tatt med Biozero-8000 mikroskop. D) Celler løslatt fra matrisen kan bli seedet på f.eks dekkglass for nærmere funksjonelle studier. Den microphotograph viser celler dyrket for 3d, senere til utgivelsen prosedyren. Farging for βIII-tubulin (rød) viser en sammenlignbar morfologi til cellene vert i 3D stillaset.
Figur 2. Flowcytometri analyse celler løslatt fra PuraMatrix. For å overvinne den tidkrevende kvantifisering av microphotographs vi brukte en protokoll for å frigjøre celler dyrket i PuraMatrix gir tilgang til raskere analyse av flowcytometri. A) Unstained celler ble brukt som negativ kontroll, for å sette porten (svart ramme) for senere analyseav f.eks βIII-tubulin celler. B) For å kvantifisere andelen av βIII-tubulin + celler i samme gate, som ligger i den negative kontrollen, ble brukt. Positive celler vises i høyre del av x-aksen, der også en mellomliggende befolkningen ble observert (stiplet ramme), mest sannsynlig representerer celleavfall. C) Sammenligningen av manuelle telte celler og cellene telles ved flowcytometri avslørte en mye høyere andel av positive celler, der tidsavhengighet av antall βIII-tubulin + var sammenlignbare, noe som indikerer påliteligheten av flowcytometri protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av 3D-stillasene tilbyr muligheten til å studere utviklingen av ulike celletyper i en cellekultur situasjon nærmere in vivo situasjonen. Men når det gjelder analyse av f.eks neuronal differensiering eller funksjonelle studier man må overvinne noen hindringer for å få pålitelige data for f.eks kvantifisering av celletyper.
Her har vi beskrev kultur hNPCs i peptid hydrogel basert stillas PuraMatrix og senere utgivelsen av cellene som skal brukes til studier i en 2D-situasjon som gir en enkel tilgang til verktøy som FACS eller funksjonelle analyser. Nylig demonstrerte vi innflytelsen fra PuraMatrix konsentrasjon om dannelsen av 3D-stillas ved atomic force mikroskopi og innflytelse på overlevelse og differensiering av cellene. 13. Imidlertid må man huske på at hver celletype kan ha behov for annen kultur forhold eller matriser som består av andre materialer f.eks matrigel eller kollagen.
Protokollen å frigjøre cellene er basert på en protokoll fra produsenten 18 og kan sammenlignes med protokoller brukes til å forberede f.eks primære neuronal kulturer hvor en mekanisk isolering av celler er etterfulgt av en fordøyelsen omkringliggende materiale av enzymer. Cellene tåler denne prosedyren og holde vitale og bygget opp prosesser og uttrykke neuronal markør som βIII-tubulin, når de er sådd igjen på en laminin belagt overflate. Her har vi utført flowcytometri studier med sluppet celler å kvantifisere mengden av βIII-tubulin + celler. I forhold til en kvantifisering gjort "manuelt" ved å telle celler i mikrografer avslørte en mye høyere andel av βIII-tubulin + celler. Dette er mest sannsynlig på grunn av høyere antall celler telles ved flowcytometeret (50.000 per probe) i forhold til manuell analyse (flere hundre per probe). Men kinetikken av antall & beta; III-tubulin + celler følger samme mønster i begge prøvene, hvor vi registrerer en nedgang på βIII-tubulin + celler over tid. Dette er i tråd med studier bruker ReNcell VM cellene. 15-17 Andre hindringer å overvinne under en manuell analyse er svært tette områder av matriser som neppe kan analyseres eller høy bakgrunn av matrisen materialet som resulterer i en undervurdering av den "virkelige" celle nummer. Vi er overbevist om at denne protokollen kan tilpasses til andre celletyper som gir en rask og pålitelig metode for å kvantifisere flere aspekter av proliferasjon, differensiering eller overlevelse av cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Norman Krüger for hans utmerkede teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T. PuraMatrix Encapsulation of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (34), e1692-e1692 (2009).
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).
