Summary
En roterande cellkultursystem som tillåter epiteliala celler att växa under fysiologiska betingelser som resulterar i 3-D-cellulär aggregatbildning beskrivs. Aggregaten genererade display
Abstract
Celler och vävnader i miljö kroppen-upplevelse förhållanden som påverkar deras arkitektur, intercellulära kommunikation och övergripande funktioner. För in vitro-modeller cellodling att exakt efterlikna vävnaden av intresse, är tillväxten miljö kulturen en viktig aspekt att beakta. Vanligen använda konventionella cellodlingssystem utbreder epitelceller på plana tvådimensionella (2-D) ogenomträngliga ytor. Även om mycket har lärt sig från konventionella system för cellodling, många fynd inte reproducerbara i humana kliniska prövningar eller vävnadsdelar vävnad, eventuellt till följd av bristen på ett fysiologiskt relevant mikromiljö.
Här beskriver vi en kultur system som övervinner många av gränserna kultur skick 2-D cellkulturer, genom att använda den innovativa roterande väggen kärl (RWV) bioreaktor teknik. Vi och andra har visat att organotypiska RWV-härledda modeller kan rekapitulera struktue, funktion och autentiska mänskliga reaktioner på yttre stimuli på liknande sätt som mänskliga explantation vävnader 1-6. Den RWV bioreaktor är en suspensionsodling system som möjliggör tillväxt av epitelceller under låga fysiologiska betingelser fluidumskjuvkraft. De bioreaktorer finns i två olika format, en hög del roterande kärl (HARV) eller en långsamt vrida i sidled (STLV) fartyg, där de skiljer sig åt genom sin luftning källa. Epitelceller sättes till bioreaktorn för val i kombination med porösa, kollagen-överdragna mikrobärarkulor (figur 1A). Cellerna utnyttjar de pärlor som en tillväxt byggnadsställning under konstant fritt fall i bioreaktorn (figur 1B). Mikromiljön som tillhandahålls av bioreaktorn tillåter cellerna att bilda tredimensionella (3-D) aggregat uppvisar in vivo-liknande egenskaper ofta inte observeras vid standardtemperatur 2-D odlingsbetingelser (Figur 1D). Dessa egenskaper omfattar tight junctions, MUCoss produktion, apikal / basal orientering, in vivo protein lokalisering, och ytterligare epiteliala cell-typspecifika egenskaper.
Progressionen från ett monolager av epitelceller till en fullt differentierad 3-D aggregat varierar beroende på cell typ 1, 7-13. Periodisk provtagning från bioreaktorn medger övervakning av epitelial aggregatbildning, cellulära markörer differentiering och livsduglighet (figur 1D). Gång cellulär differentiering och aggregatbildning etableras, cellerna skördas från bioreaktorn och liknande analyser utfördes på 2-D-celler kan appliceras på de 3-D aggregat med några överväganden (figur 1E-G). I detta arbete beskriver vi detaljerade stegen av hur kultur 3-D epitelcellsystem aggregat i RWV bioreaktorsystem och en mängd potentiella analyser och analyser som kan utföras med 3-D-aggregat. Dessa analyser innefattar, men är inte begränsade till, strukturella / morphological analys (konfokal, skanning och transmissionselektronmikroskopi), cytokin / kemokin sekretion och signalsystem cell (cytometrisk pärla array och Western blot-analys), genuttrycksanalys (real-time PCR), toxikologisk / drug analys och värd-patogen interaktioner. Utnyttjandet av dessa analyser lägga grunden för mer djupgående och expansiva studier som metabolomik, transkriptomik, proteomik och andra array-baserade applikationer. Vårt mål är att presentera en icke-konventionella medel för odling av humana epitelceller att producera organotypiska 3-D modeller som rekapitulera den mänskliga in vivo vävnad, i en enkel och robust system som ska användas av forskare med olika vetenskapliga intressen.
Protocol
Alla steg bör utföras under BSL-2 förhållanden i ett laminärt flöde.
1. Förbereda STLV Bioreaktor
- Montera STLV bioreaktorn enligt tillverkarens protokoll och utföra avgiftning för att säkra sterilitet bioreaktom. Täck öppna portar med luer lock och fyll STLV med 95% etanol i 24 timmar.
- Avlägsna etanol och fyll STLV med steriliserat destillerat vatten under 24 timmar.
- Upprepa steg 1,2 med steriliserat destillerat vatten.
- Med verktyget levereras av försäljaren, lossa alla skruvar, kapsyler och mittpluggen från STLV och autoklav vid 110 ° C i 20 min i en sterilisering påse.
- När STLV kyls, dra åt skruvarna och upprepa steg 1.1-1.4 för att säkerställa sterilitet och fullständig avgiftning.
- Dra skruvarna kyls STLV och skruva på pre-steriliserade envägs kranar till varje port.
- Öppna kranen genom att placera knapparna vertikalt.
- Avlägsna kolvarna från en 10 ml och 5 ml luer-lock-spruta och åter hylsa kolvarna tillbaka i omslag för att upprätthålla sterilitet. Skruva sprutor på kranar (Luer-lock-tip sprutor krävs för detta steg).
- Tillsätt Dulbeccos fosfat-buffrad saltlösning (DPBS) till 10 ml sprutan tills den STLV är full och börjar fylla 5 ml spruta.
- Byt sterila kolvarna i varje spruta och ta bort resterande bubblor uppstår i bioreaktor genom att växla mellan att köra kolvar i sprutorna.
- Låt sprutorna knutna till bioreaktor efter att ha tagit alla bubblor. Stäng kranar och fästa STLV till den roterande vertikal plattform och rotera i minst 24 timmar för att övervaka efter läckor.
2. Förbereda mikrobärarpärlor
- Tillsätt 15 ml DPBS till ~ 250 mg cytodex mikrobärarpärlor i en 50 ml koniskt rör och autoklav under samma förhållanden som STLV (1,4).
- Efter kylning, ta bort DPBS, lägga medier som används för att odla epithelial cell av intresse och snurra röret återsuspendera pärlor.
- Upprepa tvättsteg med medium två gånger till. Efter sista tvätten lägga 15 media ml tillväxten pärlor.
3. Sådd Epitelceller och pärlor i STLV Bioreaktor
- Väx epitelceller av intresse som monoskikt i vävnadsodlingskolvar tills du får ≥ 1x10 7 celler. Avlägsna celler från kolven (dvs trypinsization, EDTA), räkna celler för att etablera cellulära koncentrationen, och bestämma cellemas livsduglighet genom trypan blå exklusion färgning 1.
- Till koniska rör som innehåller färdiga pärlor (se 2,3), tillsätt önskad koncentration av celler (2x10 5-1x10 7 epitelceller) 2, 8, beroende på din epitelial celltyp of intent (Figur 1A). Se alla celler överförs genom sköljning av koniskt rör.
- Ta bort DPBS och sprutor från STLV.
- Ta bort kontakten från centrum hamnen och lägga till epiteliala cell / pärlsuspension till STLV med användning av 10 ml serologisk pipett. Skölj koniska röret till att alla celler / pärlor överförs till STLV och ersätta mitt pluggen.
- Ta bort kolvarna från en 5 och 10 ml sprutor och re-ärm kolvar tillbaka i omslag för att bibehålla sterilitet. Skruva sprutor hamnar med öppna kranar. Fyll STLV med media, byt kolvar och nära kranar.
- Placera nysådda STLV i en 37 ° C inkubator under 30 minuter utan någon vridning.
- Öppna kranar, ta bort bubblor med kolvarna och sedan nära kranar.
- Placera STLV i en 37 ° C, 5% CO2 fuktad inkubator som roterade med 20 varv per minut (figur 1B). Kulturer måste roteras kontinuerligt 24 hektar dag utom vid provtagning byte av media eller aggregat skörd (se nästa avsnitt).
4. Odling, Provtagning och Foto Dokumentation av kulturer
- Efter en inledande 96-120 h av odling av celler i den bioreactor, ändra media genom att luta STLV och låta celler / pärlor att bosätta sig. Ta sprutor, öppna båda kranarna, och häll bort ~ 75% av media från sidan hamnen (Figur 1C). Baserat på cellulär metabolism av media, ändra media varje dag eller varannan dag efter initial sådd och 96-120 h. kultur period.
- Skruva på 5 och 10 ml sprutor tomrum kolvar och följa återmatning protokoll som beskrivs ovan (1,7-1,11), skruva sedan stängde STLV tillbaka på roterande plattform.
- Övervaka tillväxt och viabilitet av aggregat var 5-7 dagar efter ympning in i den STLV genom att försiktigt avlägsna en liten mängd aggregat (~ 200 | il) från centrum porten i två 1,5 ml rör. För att undvika sammanlagda klippning för alla samlade överföringar använder en 1000 xl pipettspets som har skurits ~ 2 cm ur och steriliseras.
- Byt mittpluggen, utbyte med nya sprutor, lägga nya media till STLV som beskrivits ovan (1,7-1,11) och placera STLV tillbaka iinkubator med rotation (se 3,8).
- För övervakning av cellulär bärkraft, använda en av de två 1,5 aggregaten ml tub alikvoterades i steg 4,3 och ta bort celler från pärlor på samma sätt de epiteliala cellerna avlägsnas från vävnadsodlingskolvar (dvs. trypsinisering). Övervaka livsduglighet genom trypan blå exklusion färgning 1.
- För avbildning cellulära aggregat, tillsätt 0,5-1 ml av media för att den andra 1,5 ml sammanlagda alikvot och överför till en liten petriskål med en cut-off 1000 il pipettspets. Bild aggregat som använder en inverterat ljusmikroskop (Figur 1D).
5. Överföra och skörd Ballast
- För vissa epitelceller modeller är det nödvändigt att överföra aggregaten till en engångs HARV att öka kultur luftning 2. Ungefär en vecka före skörd aggregat för analys, ta bort sprutor och kranar från STLV och häll bort ~ 50% av media från sidan hamnen.
- Remove i STLV centrum plug and häll försiktigt allt innehåll i en 50 ml koniskt rör från centrala hamnen (Figur 1E). Skölj STLV två gånger med 5 ml media och kombinera skölj med resten av aggregat.
- Fortsätt med att överföra de aggregat som beskrivs i 5,2, men aggregat överföring från 50 ml koniskt rör till HARV.
- Noggrant skörd aggregat från HARV efter ~ 1 vecka eller från STLV (baserat på celltyp) som utfördes ovan (5,2). Se nedan för eventuella assay format, analyser och analyser efter sammanlagda skörd.
6. Potentiell analys, program och analyser genomförts med Ballast
- Ympning aggregat för olika experimentella format. Överföring önskade mängden aggregat från 50 ml koniskt rör på ett 1,5 ml rör, platta med 24 brunnar, eller 96-brunnars platta med användning av en steriliserad cut-off 1000 mikroliter pipettspets (figur 1 F).
- Tvättning och förberederning aggregat för analys. Ta bort media efter aggregat har lösts. Fördela DPBS direkt till centrum av röret eller väl så att alla aggregat rörs upp. När aggregat har sjunkit till botten, ta bort DPBS och upprepa så många gånger som behövs.
- Frakt aggregat för off-site experiment och analyser. Lägg önskad mängd av aggregat till ett 50 ml rör och tvätta aggregat som i 6,2. Helt fylla 50 ml tub med media, mössa och parafilm i närheten av Cap för att undvika läckage. Säkert skicka aggregat till önskad plats över natten vid rumstemperatur.
- Fastställande aggregat för elektronmikroskopi (figur 2). Scanning, överföring eller immuno-elektronmikroskopi kan genomföras genom att överföra 150-300 jil aggregat till ett 1,5 ml rör och tvätt aggregat 3 gånger med DPBS (6,2). Tillsätt 200 pl av applikations-specifik (SEM, TEM, immuno-EM, etc) elektronmikroskopi fixativ för den önskade inkubationsperioden. Ta fixa, tvätta aggregatES 2 gånger med DPBS och fortsätt beskrivs som i Hjelm et al. 2010 för scanning och transmissionselektronmikroskopi 2.
- Immunofluorescensmikroskopi imaging (Figur 3). Transfer ~ 100 il aggregat till ett 1,5 ml rör och aggregat tvätt (6,2). Fix och aggregat etikett med antikroppar på liknande villkor som med monoskikt, förutom i ett 1,5 ml rör. Att montera, sätta 1 droppe montering media på objektglas, överför märkta aggregat på toppen av montering media med en cut-off 1000 il pipettspets, plats täckglas över aggregat, tätning täckglaset med nagellack, och torr bild över natten 2.
- Mätning cellulär viabilitet / proliferation med MTT-analys (Figur 4). Transfer aggregat till en platta med 24 brunnar och ersätta media med 625 pl fenolrött fria medier. Tillsätt 62,5 | il av 5 mg / ml tiazolylblått tetrazoliumbromid (MTT) till varje brunn och inkubera under 4 h vid 37 ° C. Tillsätt 625 pl av 100 mg / ml SDS-0,01M HCl till varje brunn och inkubera över natten. Avlas absorbansen vid 570 nm och erhålla viabilitet% cellen med användning av ekvationen:
- Toxikologistudier. Överföring aggregat till 24-brunnars platta och utföra trypanblåttuteslutning på ≥ 2 brunnar för inledande cellernas livskraft / koncentration. Tillsätt testförening vid varierande koncentrationer till dubbla brunnar. För cellviabilitet (figur 5A), tvätta aggregat och utför trypanblåexklusion efter behandling. För TC 50 (figur 5B), ta cellulär livsduglighet duplikatbrunnar för varje koncentration med tiden och användningen Reed Muench-metoden för att bestämma toxisk koncentration 50% 2, 15.
- Cytometrisk vulst matris (CBA) eller ELISA. Cellulära supernatanter kan tas efter sådd celler i någon diagramform experimentell format. Stimulera sådda aggregat som med celler odlades sommonoskikt, samla supernatanter (≥ 120 | il) och lagra vid -80 ° C för analys genom ELISA eller CBA (figur 6).
- RNA-analys. Överför ≥ 500 | il av aggregat till 1,5 ml rör och aggregat tvätt med DPBS. Fortsätt extraheringen med Qiagen RNAeasy kit och protokoll för djurceller med homogenisering av lysat med 20-gauge nål. Se till att låta pärlor avsätts i botten av röret före överföring supernatant, och inte överför tomma pärlor till spinnkolonn (pärlor kommer att täppa kolumnen membranet resulterar i låg RNA avkastning) (Figur 7).
- Proteinanalys. Harvest aggregat enligt samma metoder som med monolager med hjälp av en 1,5 ml tub eller större experimentell format. Emellertid, efter lys av de aggregat, tillåter pärlorna sedimentera och överföra lysatet till en separat rör innan en proteingel eller annan form av proteinanalys (figur 8).
- Infektionundersökningar. Seed aggregat till önskad experimentell format. Använd minst två brunnar / prov för trypsinizing celler från kulor att räkna antalet celler och kvantifiera cellviabiliteten. Infektera aggregat med patogen av intresse valt infektionsmultiplicitet som utförts med celler som odlats som monoskikt (Figur 9). Tvättsteg måste utföras som i 6,2.
- Flödescytometri: Seed aggregat i 50 ml rör, aggregat tvättbetingelser (6,2), och tillsätt 2 mM EDTA under 5-10 min vid 37 ° C. Tillsätt 5-10 ml medium till celler och passera celler genom en cellfilter. Alikvot 1x10 ^ 6-celler till ett polypropenrör och celler tvättstegen i kall blockeringslösning (1% FBS i PBS). Resuspendera celler med antikroppen och inkubera beroende på tillverkare. Tvätta cellerna genom centrifugering, återsuspendera i PBS och celler överföring för att filtrera rör för analys (figur 10).
7. Representativa resultat
Ett exempel påen differentierad human epitelial aggregat odlas i STLV bioreaktorsystem kan ses i figur 2. SEM och TEM bilder är hämtade från humana vaginala celler odlas i STLV under 39 dagar, där microridges och invaginationer och intracellulära vesiklar sekretoriska och mikrovilli på apikala ytan kan observeras. Ytterligare demonstration av in vivo-liknande egenskaper epitelceller odlade i bioreaktorn kan observeras genom konfokala immunofluorescensmikroskopi bilder (figur 3) av 3D-vaginala celler som uttrycker mucin (MUC1) och markörer som är specifika för epitelceller (ESA) och terminal differentiering (Involucrin; INV).
Som framgår, 3-D aggregat visa ultrastrukturella egenskaper liknande vävnader, men deras mer fysiologiskt relevanta fenotyper också fungera som en utmärkt plattform för att utvärdera toxiciteten av föreningar. MTT-analysen, en vanligen använd analys för att mäta cellernas livsduglighet, metabolism eller proliferaning, kan användas för att mäta toxiciteten mot olika kemikalier och föreningar (figur 4). Triton X-100, en detergent som förstör cellmembran, användes som en positiv kontroll för validering av MTT-analysen. En ytterligare metod för att mäta toxiciteten efter behandling med testföreningar är trypanblåttuteslutning (figur 5). Efter behandling med den nonoxynol-9 (N-9), visade de vaginala aggregat en toxicitet som svar liknande det i cervikala explantation modeller, utan en annan profil jämfört med monoskikt 2, 16.
Ytterligare studier som visar förmågan hos epitelceller, odlas i bioreaktorn för att fungera och signalera på liknande sätt som vävnad in vivo, kan observeras i Figur 6. Vid stimulering med molekyler som härrör från mikrober som känns igen av Toll-liknande receptorer (TLR), aggregaten reagera och utsöndra proinflammatoriska cytokiner, inklusive IL-6 1.Expression av progesteronreceptor (PR), en receptor som svarar på hormoner stimulering, kan också observeras i de vaginala celler både vid RNA-och proteinnivåer (Figur 7 och figur 8, respektive). 3-D-aggregaten inte bara har möjlighet att svara på patogen och hormon molekyler, men kan också funktionellt stödja ett herpes simplex virus typ 2 (HSV-2) infektion. En konfokalmikroskopi bild av HSV-2 infekterade 3-D vaginala aggregat (Figur 9) visar infektion. Parallella 2-D vaginala epiteliala cellodlingar visas inte som ett resultat av den svåra celldöd orsakad av HSV-2 infektion. RWV-härledda 3-D-aggregat har också använts för att kvantifiera bakteriell och viral replikation genom intracellulära tillväxt-kurvor och analyser plack, respektive 8, 9. Slutligen kan de fysikaliska och funktionella egenskaper hos enskilda celler i aggregat också kvantifieras genom flödescytometri. Säljas från lagretle, använde vi en analys flödescytometri för att mäta MUC1 ytan uttryck på enskilda vaginala celler (Figur 10). Vaginal 3-D aggregat uttryckte en lägre andel MUC1 (27,7%) jämfört med monolager (67,2%). Den lägre procentandel av MUC1 på 3-D-aggregat yta jämfört med monoskikt kan vara en följd av de flesta MUC1 utsöndras från cellerna som observeras i vaginan 17, 18.
Figur 1. Schema för odling av humana epitelceller i RWV och potentiella tillämpningar som använder RWV-de aggregat. A) Epitelceller initialt växa såsom monoskikt i en vävnadskulturkolv. Gång sammanflytande, avlägsnas cellerna från kolv och kombinerades med mikrobärarpärlor i STLV bioreaktorn. Skala bar: 80 m B) STLV roterar på en plattform för att skapa ett konstant fritt fall miljö med låg fluid skjuvning, vilket gör att cellerna att fästa och växa på pärlor och därmed bildar synliga cellulära aggregat. c) Efter 96 h, media i STLV måste ändras för att rymma för cellulär metabolism. Mediet hälls ut på en sidoport är färskt medium ersatt genom en ansluten 10 ml spruta (kolv avlägsnats), och sprutan kolvarna är ersatta och användes för att strängspruta bubblor.) D Efter ~ 5 dagar (d) de aggregat börjar bildas . Aggregaten samplas var 7 dagar och avbildas med ljus mikroskopi för att följa upp deras utvecklande progression (20x förstoring av 3-D humana epitelceller vaginala celler). E) När du är klar aggregat bildas och cellulär differentiering har skett, är aggregaten skördas från bioreaktorn och överförs till en 50 ml koniskt rör. F) aggregat kan ympas in i ett 1,5 ml rör eller en platta med flera brunnar format för att utföra experimentell analys och tester.) G Sammanfattning av pote ntial analyser och analyser som kan genomföras på aggregat. Denna representativ lista av analyser är inte avsedd att vara en uttömmande katalog över alla potentiella tillämpningar i efterföljande led.
Figur 2. Undersöker morfologiska och strukturella egenskaper hos 3-D epiteliala cellaggregat med hjälp av elektronmikroskopi. (A) Svepelektronmikroskopi (SEM) bild av en 3-D-human epitelial vaginala cellaggregat. Skalstrecken: 200 nm (100x), 100 | im (200x), 50 ^ M (500x). Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bild av en 3-D human epitelial vaginal cellen aggregat med pilar som pekar till (B) intracellulära sekretoriska vesiklar och mikrovilli eller (c) cytoplasmiska processer ". Skala staplar: 2 m (modifierad från Hjelm et al 2010). 2.
g3.jpg "/>
Figur 3. Konfokal immunofluorescens-mikroskopi användes för att identifiera junktional differentiering och markörer protein i 3-D-epiteliala cellaggregat. Human 3-D-vaginala celler skördade från bioreaktorn efter 32 dagar, fixerades och färgades med (A) mucin antikropp MUC1, (B) antikroppar specifika för epitelceller, ESA, eller (c) Anti-Involucrin (INV) antikroppar som känner igen terminalt differentierade epitelceller. Aggregaten indirekt märkt med Alexa 488 sekundär antikropp (grönt). Skala bar: 60 m (modifierad från Hjelm et al 2010). 2.
Figur 4. MTT-analysen användes för att mäta cellulär viabilitet. Ympades i en 24 brunnsplatta och behandlades med medium enbart (obehandlad) eller 0,01%, 0,1% eller 1,0% Triton X-100 detergent under 1 h vid 37 Human 3-D-vaginala aggregat ° C. Followin g behandlingen, avlägsnades mediet och MTT-analysen utfördes för att mäta cellulär viabilitet. ** Betecknar p <0,001; en-svansat Students t-test jämför Triton X-100-behandlade celler med obehandlad kontroll.
Figur 5. Användning av 3-D epiteliala cellaggregat för att screena förening toxicitet. (A) Nonoxynol-9 (N-9) dosberoende livsduglighet kurva 24 h efter behandling av 3-D humant vaginala epitelceller modell (röd linje / staplar) jämfört med samma celltyp odlades såsom monoskikt (svart linje / staplar). (B) N-9 TC 50 nivåer av vaginala epitelceller cellkulturer i (A) vid 1,5 timmar, 4 timmar, 8 timmar, och 24 h efter behandling. * Representerar p <0,05, ensidigt Students t-test jämför monolager till 3-D-celler vid varje exponeringstid. (Modifierad från Hjelm et al. 2010) 2.
/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
Figur 6. Analys av cytokin-produktion i 3-D-epitelceller som svar på Toll-liknande receptor (TLR) agoniststimulering. Tre-D humana vaginala celler stimulerades med FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , och CL097 (TLR7 / 8) i 24 h och utsöndrade cytokiner mättes genom cytometrisk vulst matris. IL-6 är visad som en representativ proinflammatorisk cytokin som produceras och mättes. * Representerar p <0,05, ensidigt Students t-test jämför stimulerade prover som PBS grupp. (Modifierad från Hjelm et al. 2010) 2.
Figur 7. Övervakning av genuttryck i 3-D-epitelceller. Semi-kvantitativ RT-PCR-analys av progesteronreceptor (PR)-uttryck i monoskikt (ML) eller 3-D-humana vaginala epitelceller. GAPDH visas som en laddningskontroll. Amplifieringsproduktersom visas är en följd av transkript uttryck uppträder efter 30 PCR-cykler. pilhuvuden punkt till PR band enda som inträffar i 3-D-samplet.
Figur 8. Proteinuttryck analys av 3D-epitelceller. Western blot-analys av monoskikt och 3-D humana vaginala epitelceller hela cellysat (30 ^) sonderades med en anti-progesteronreceptorn (PR)-antikropp. β-tubulin användes som en prob för lastning kontroll.
Figur 9. Tre-D human epitelcell modell stöder en produktiv virusinfektion. Konfokal immunofluorescensmikroskopi bild av 3-D human vaginal epitelcell sammanlagda infekterad med HSV-2. Celler infekterades vid ett MOI av 1,0 i två timmar, tvättades, fast 24 h efter infektion (4% PFA), och färgades med en HSV-2-specifik VP5 capsid antikropp (grön) och den nukleära fläcken DAPI (blå). Skala bar: 50 nm.
Figur 10. Individuell cell analys i 3-D-human epitelcellinje modell med flödescytometri. (A) monoskikt eller (b) 3-D humana vaginala epitelceller aggregat dissocierades med EDTA, märkt med en FITC-konjugerad antikropp MUC1 (blå), en isotypkontroll (grön), eller PBS (röd) och FITC-expression kvantifierades genom flödescytometri. Siffrorna representerar procentandelen celler som färgades positivt för mucin antikropp som fanns kvar efter grindning ut bakgrundsfluorescens från de färgade isotypkontroll-celler. Icke-likformiga toppar är en följd av de många glycosolation mönster och ett ojämnt MUC1 på ytan av dessa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utnyttjande av RWV bioreaktorn tekniken presenteras här kan ge forskare möjlighet att öka sin nuvarande systemet cellkultur till en mer fysiologiskt relevant organotypisk cellodling modell. Den RWV bioreaktor cellodlingssystem tillhandahåller en lågskjuvande mikromiljö som möjliggör cellerna att bilda 3-D cellulära aggregat med in vivo-liknande egenskaper, inklusive tight junctions mucinproduktion och extracellulära processer (dvs. mikrovilli) och cellulär polaritet. Majoriteten av de uppgifter och exempel som presenteras här använder vaginala epitelceller som odlas i RWV systemet, men den RWV systemet också har använts för att kultur andra epiteliala celltyper, inklusive tunntarm och tjocktarm, lunga, urinblåsa, lever och tonsill epitelceller för att bilda 3-D organotypiska modeller 1, 7-13, 18. Dessutom har detta system använts för att typerna kultur cell annan än epitelceller, och för närvarande utvecklingen av komplexa, multicellular organotypiska odlingsmodeller pågår 2, 18.
Protokollen som beskrivs här är tänkt att fungera som en guide, och kan behöva ändras baserat på celltypen av intresse. De vanligaste modifieringar av protokoll för att odla epitelceller i RWV systemet innefattar den tid cellerna odlas i STLV, beslut och timing av stenmaterial överföring från STLV till HARV, och cellen / pärla förhållandet för den initiala sådd i STLV. En mera specialiserad modifiering som kan övervägas för framgångsrik aggregatbildning är egenskaperna hos den mikrobärare pärla eller byggnadsställning, såsom ytarea, diameter, form, ytbeläggningar, densitet, laddning, kärnmaterialet, och porositet. Dessutom kan justering av basen odlingsmediet, formulering, eller tillägg, vara nödvändigt för att optimera de odlingsbetingelser och maximera aggregatbildning. Justeringar kan också göras till bioreaktorn systemet och dess komponenter, isive storlek bioreaktorn kärlet och rotationshastigheten. För en förbättrad bedömning av mikromiljö i bioreaktom är en perfunderade kultur system också tillgänglig som möjliggör kontinuerlig övervakning av pH, syre och glukos nivåer inom odlingskärlet säkerställa en produktiv miljö för aggregatbildning. Den potentiellt lång tid för att optimera Odlingsbetingelserna aggregatbildning, cellulär differentiering och för att karakterisera varje ny modell systemet, såväl som den initiala kostnaden för bioreaktorsystem, är anmärkningsvärda nackdelar med detta system. Men kommer varje ny kultur som är implementerat i ett laboratorium har liknande nackdelar.
Vi och andra har visat att RWV-härledda modellerna använder mänskliga celler kan vara ett värdefullt verktyg för att förutsäga effekten, toxicitet och farmakokinetik av vacciner, mikrobicider, biologiska och läkemedel på ett sätt som är relevant för människa 1, 2, 18. Med framgången av eär bioreaktor kulturen för att producera autentiska mänskliga reaktioner i kombination med dess flexibilitet, är tillämpningar av RWV bioreaktorn systemet för närvarande byggs ut till sådana områden som tumören modellering, regenerativ medicin, och tissue engineering 2, 18-23. Att främja våra RWV-genererade slemhinnor modeller vi arbetar för att skapa en mer komplex flercellig system som replikerar både struktur och funktion av människans slemhinnevävnaden. Men författarna erkänner att det kan vara nödvändigt att använda eller integrera flera modellsystem för att reproducera de komplexa interaktioner som läkemedel eller vaccin har med mänskliga fysiologiska system. Totalt sett är vårt mål att använda RWV bioreaktorn och dess experimentella tillämpningar för att bättre förstå slemhinnevävnad biologi och de cellulära svaren miljö förolämpningar i mänskliga organotypiska modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Brooke Hjelm för hennes teknisk expertis och Andrew Larsen för hans proteinanalys. Detta arbete har finansierats delvis av Alternativ Research Development Foundation (MMHK) Grant och NIH NIAID sexuellt överförbara infektioner och utvärtes mikrobicider kooperativa Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi erkänner tacksamt Biology of Reproduction för återanvändning av siffror.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | Bio-Rad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR international | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | Bio-Rad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma-Aldrich | C3275 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon International | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma-Aldrich | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR international | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Biosciences | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Biosciences | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Biosciences | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Biosciences | 352058 | |
| PR antibody | Dako | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR international | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | MedexSupply | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD Biosciences | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD Biosciences | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
