Summary
Indsamlingen af inficeret skovflåt hæmolymfe, spytkirtler, og spyt er vigtigt at undersøge, hvordan skovflåtbåren patogener forårsage sygdom. I denne protokol vi vise, hvordan man indsamler hæmolymfe og spytkirtler fra fodring
Abstract
Flåter findes over hele verden og plage mennesker med mange kryds-bårne sygdomme. Flåter er vektorer for patogener, der forårsager borreliose og skovflåtbåren recidiverende feber (Borrelia spp.), Rocky Mountain spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis og E. equi), anaplasmose (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick- borne encephalitis virus), babesiose (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus) og tularæmi (Francisella tularensis) 1-8. For at blive ordentligt overføres til værten disse smitstoffer differentielt regulerer genekspression, interagere med tick proteiner, og vandrer gennem kryds 3,9-13. For eksempel, tilpasser Lyme sygdomsagensen, Borrelia burgdorferi, gennem differentiel genekspression til festen og hungersnød stadier af skovflåten har enzootisk cyklus 14,15. Som en Ixodes kryds forbruger enblodmel Borrelia replikere og migrere fra mellemtarmen i hemocoel, hvor de rejser til spytkirtlerne og transmitteres i værten med den udstødte spyt 9,16-19.
Som et flueben feeds værten typisk reagerer med en stærk hæmostatisk og medfødte immunrespons 11,13,20-22. Til trods for disse værtsresponser, I. scapularis kan foder til flere dage, fordi tick spyt indeholder proteiner, der er immunmodulerende, lytiske agenter, antikoagulanter og fibrinolysins at hjælpe skovflåten fodring 3,11,20,21,23. De immunmodulerende aktiviteter besat af tick spyt eller spytkirtel ekstrakt (SGE) lette fremsendelsen, spredning og formidling af talrige tick patogener 3,20,24-27. For yderligere at forstå, hvordan skovflåtbåren smitstoffer forårsage sygdom er det vigtigt at dissekere aktivt fodring flåter og indsamle tick spyt. Videoen protokol viser dissektion teknikker tilindsamling af hæmolymfe og fjernelse af spytkirtler fra aktivt at fodre I. scapularis nymfer efter 48 og 72 timer efter mus placering. Vi har også demonstrere spyt samling fra en voksen kvinde I. scapularis tick.
Protocol
1. Hæmolymfe kollektion for præparatet
(Movie 1)
- Forsigtigt fjernes aktivt fodring blodmider fra et dyr og placeres i 3% topisk hydrogenperoxid i 5 minutter og derefter i 70% ethanol i 10 minutter til overfladen sterilisere.
- Med en pap pen tegne en cirkel på en silan belagt objektglas og placere kryds i pap pen cirkel.
- Silan coatede objektglas anvendes til bedst vedhæftning af hæmolymfe til mikroskopobjektglasset.
- Se kryds under et dissektionsmikroskop (1X mål, 10X okular, 3,5 x forstørrelse).
- Tryk forsigtigt ned på kryds har dorsum med en pincet til at sprede flåten ben og immobilisere kryds.
Bemærk: Når immobilisere kryds ikke trykker for hårdt, da dette kan forstyrre mellemtarmen eller punktere kryds og forurene hæmolymfe.
- Amputere kryds ben eller ben på the distal fælles med en fin spids engangs skalpel. For at bestemme infektivitet via hæmolymfe kun 1 ben skal amputeres. For samling af hæmolymfe på et dias flere ben kan amputeres.
Bemærk: Du må ikke skære benet for tæt på kroppen, fordi det kan forårsage midttarm forurening af hæmolymfe.
- Efter eller begge ben er skåret fortsat forsigtigt lægge pres på kryds har dorsum for hæmolymfe at udskille ud af benene ned på diaset. Bevæg forsigtigt kryds rundt på diaset for at sprede hæmolymfe.
2. Spytkirtel fjernelse
(Film 2 & 3)
- Stedet flere 25 ul puljer af phosphatbufret saltvand (PBS) på et objektglas og placere et hak i en af de PBS pools.
- Se kryds under et dissektionsmikroskop (1X mål, 10X okular, 3,5 x forstørrelse).
- Stabilisere kryds med fine tippet forceps ved at holde ud lårbenshovedet (mund dele) eller bagsiden af kryds.
- Sæt de fine tippes tang ind i bagsiden af kryds og skær op i kryds er dorsum at afsløre de organer. Hvis det ønskes mellemtarmen kan fjernes på dette tidspunkt og overføres til en frisk pulje af PBS på et objektglas, eller til et mikrocentrifugerør indeholdende PBS.
- Finde parret af spytkirtlerne (drue-lignende klynger) placeret bilateralt sammen benene af kryds. Hvis spytkirtlerne ikke er synlige blandt blodmiden debris bevæge den primære kryds del, der stadig indeholder spytkirtlerne, at en ny pulje af PBS for at reducere afbrydelsen og tab af spytkirtlerne.
Bemærk: Tidligere i en ernæringssonde, spytkirtlerne er sværere at lokalisere, fordi de ikke så udviklet sammenlignet med senere i fodring.
- Fjern spytkirtlerne fra kryds med fine tippes tænger og sted i en ny pulje af PBS.
- With fin tippet pincet overføre spytkirtlerne til en anden ren 25 gl PBS pool, gentage dette vasketrin 3-4 flere gange for at fjerne eventuelle eksterne mikroorganismer og tick vragrester.
Bemærk: Vask spytkirtlerne klynger forsigtigt for at reducere tab og afbrydelse af de enkelte spytkirtler.
- Placerer kirtler i en ren pulje af PBS på en silan overtrukket objektglas eller et mikrocentrifugerør indeholdende PBS.
3. Spyt samling
(Movie 4)
- Fjern forsigtigt voksne kvindelige flåter fra kanin eller anden vært ved hjælp af fine tippes pincet lige før de falder ud fuldt engorged, ca 5-7 dage efter vedhæftede.
- Klæbe næsten engorged kryds på den ene ende af et objektglas med tape. Tapen skal placeres cirka ¾ af vejen op skovflåten har dorsum mod hovedet, forlader skovflåten Grundlaget lårbenshovedet (mund dele) udsættes.
- Hvor båndet opfylder den forreste kant af blodmider dorsale overflade pipette 5 gl 5% pilocarpin-opløsning (i methanol). Tillader båndet at opsuge det pilocarpin i blodmiden s dorsum, uden at tillade pilocarpin at komme i kontakt med kryds Grundlaget lårbenshovedet.
- Monteres et stykke ikke-toksisk modellerleret på objektglasset ca inch fra blodmiden s munddele.
- Med fin tippes pincet brække spidsen af en trukket kapillarrør 28 til den ønskede diameter.
- Se kryds Grundlaget lårbenshovedet under et dissektionsmikroskop.
- Forsigtigt passer kryds har hypostome i trak kapillarrøret lade maxillære palps at opholde sig på ydersiden af kapillarrøret.
- Tryk den modsatte ende af kapillarrøret i modellerleret at holde kapillarrøret på plads.
- Placer monteret salivating kryds inde i et mørkt kammer med høj luftfugtighed (f.eks, en låg styrofoam æske foret med vådt pap ER håndklæder). Vippe glider så hypostome punkter til bunden af beholderen, så tyngdekraften for at hjælpe med spyt samling.
- Beholderen anbringes ved stuetemperatur.
- Nøje overvåge salivating flåter i den første time, og indsamle spyt, da det er genereret ved at udstøde det ud af kapillarrørene med en Pasteur-pipette pære. Efter den første time, se akkumulering hver time i mindst 4 timer. Fortsæt med at indsamle spyt, som den er genereret.
Bemærk: Spyt købet kan stoppes, når nok spyt er indsamlet til undersøgelsen udføres.
- Hvis tæger ikke salivating eller flere spyt er påkrævet, kan spytafsondring lejlighedsvis blive induceret ved hjælp af kapillarrøret at massere hypostome.
- Tilsæt 0,1 rumfang proteaseinhibitor-cocktail til spyt og opbevares ved -80 ° C indtil brug.
4. Repræsentative resultater
e_content "> film 1 viser, hvordan man holder et delvist fødes I. scapularis nymfe-og amputere benene til at indsamle hæmolymfe på et mikroskopobjektglas. Når benet eller benene er amputeret en klar væske udskilles (figur 1A og 1B). Hvis mellemtarmen brydes den hæmolymfe uklar, da det er kommer ud af den amputerede ben (s) (figur 1C og 1D).Ekstraktion af spytkirtlerne efter nymfen er fodring til 48 eller 72 timer er vist i film 2 og 3. Efter kryds punkteres der generelt meget debris (bestående af trachea, malpighian tubuli, blod, bindevæv etc.), for at forhindre tab eller ødelæggelse af spytkirtlerne flytte kryds en ny pulje af PBS. Figurerne 2A og 2B viser, hvor spytkirtlerne er placeret efter nymfen er blevet skåret op og figur 2C viser fjernet spytkirtel klynger i en pulje af PBS.
Spyt kollektion sat op fra I. scapularis voksne hunner i s vist i filmen 4 og figur 3. Et kryds salivating i et kapillarrør er observeret i filmen 5. Denne metode af spyt anvendte indsamlingsmetoder pilocarpin til at stimulere spytsekretion og kan give mere end 20 gl spyt per voksen kvinde kryds.
Figur 1. Mærkede strukturer af en I. scapularis nymfe.
Movie 1. Ixodes scapularis hæmolymfe samling. Klik her for at se film .
Figur 2. Uforurenet (A & B) og forurenet (C & D) hæmolymfe væskende fra nymfen ben.
Movie 2. Spytkirtel udtræk fra en 48 timers fodret I. scapularis nymfe.pload/3894/3894movie2.avi "> Klik her for at se film.
Movie 3. Spytkirtel udtræk fra en 72 timer fodret I. scapularis nymfe. Klik her for at se film .
Figur 3. Ixodes scapularis nymfen spytkirtler. (A & B) Eksempler på spytkirtler i en 72 timers fodret nymfe, før ekstraktion. (C) fjernes spytkirtel klynge.
Movie 4. Spyt kollektion sat op fra en voksen I. scapularis kvindelige kryds. Klik her for at se film .
Figur 4. Spyt kollektion fra voksne I. scapularis kvindelige ticks. (A & B) Kryds monteret på et objektglas med hypostome i trækkes ende af kapillarrøret med unpulled ende af kapillarrøret, som modellervoks. (C & D) fugtigt kammer, der indeholder salivating voksen I. scapularis kvindelige tæger.
Movie 5. Ixodes scapularis kvindelig flåter salivating i et kapillarrør. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indsamlingen af tick hæmolymfe, spytkirtler, og spyt er vigtig i studiet af skovflåtbåren patogen transmission, udbredelse, formidling, spredning og persistens i både kryds og værten 6,11-13,20,23,29. Der er flere måder at dissekere en flåt 30,31. Men i forbindelse med indsamling spytkirtler er det afgørende at dissekere den skovflåten ordentligt, så spytkirtlerne ikke brydes eller tabt i skovflåten resterne. Når de spytkirtlerne fjernes fra blodmiden de skal vaskes adskillige gange for at fjerne mellemtarmen kontaminering og kan derpå fastgøres på et objektglas til farvning eller formalet i PBS til opnåelse af spytkirtlen ekstrakt (SGE). SGE er lettere at samle end spyt og har egenskaber svarende til spyt, og derfor kan den anvendes som en spyt alternativ. Imidlertid SGE indeholder yderligere proteiner, der hidrører fra spytkirtlerne celler, der ikke er til stede i kryds spyt. Tilføjelsen af ekstra proteiner i SGE kan Be en fordel eller en ulempe afhængigt af studiet, der udføres, men er noget en forsker skal være opmærksom på når du arbejder med SGE. SGE har den fordel, at pilocarpin ikke anvendes under samlingen af spytkirtlerne. Pilocarpin, en muskarin cholinomimetisk stof, der virker som en agonist af redning, har vist sig at have en cytotoksisk virkning på B. burgdorferi i spyt indsamlingen 32,33. Dopamin er en agonist for spytafsondring, men hurtigt ødelægges af hæmolymfe og andre markeringer fluider sammenlignet med pilocarpin, der har en vedvarende virkning 33. Andre stimulatoriske teknikker er blevet udforsket for spyt indsamling og alle viste sig at påvirke spyt sammensætning 34.
Hæmolymfe samling kan være vanskelig, fordi tæger bevægelse og det kan være problematisk at immobilisere dem uden brud mellemtarmen. Immobilisere kryds med dobbeltklæbende tape er en mulighed, men hæmolymfe kan gå tabt på båndet, hvis kryds ikke fjernes. Andre undersøgelser har indsamlet hæmolymfe fra flere flåter ved at skære kryds ben på de distale led og bruge centrifugering at indsamle hæmolymfe 16,35. Når hæmolymfe kollektion mestrer hæmolymfe kan bruges til at bestemme tick infektivitet, kryds til patogen interaktioner, og migrationen af patogener fra mellemtarmen til spytkirtlerne.
Selv vores laboratorium fokus er på B. burgdorferi og I. scapularis flåter og de teknikker, der er nævnt i denne protokol kan bruges til at studere andre kryds-bårne smitstoffer og kryds arter. Endvidere kan disse teknikker også anvendes på nymfer eller voksne med relativ lethed. Ved hjælp af disse teknikker med larve kan være en udfordring på grund af deres størrelse. Indtil dissektion teknikken er styr på det foreslås at anvende inficerede flåter. Det er også vigtigt at udøve de rette biosikkerhed foranstaltninger, når dissekere infektionTED eller felt indsamlet tæger. Metoderne i denne video protokol kan anvendes som retningslinjer for hvordan man foretager tick dissektioner og hvad man skal kigge efter, når du udfører disse teknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke afdelingen for vektorbårne sygdomme Animal Resources Branch, især Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, og John Liddell for deres pleje og vedligeholdelse af mus og kaniner. Vi vil også gerne takke Amy Ullmann, Theresa Russell, og Barbara J. Johnson for deres bidrag til at dette manuskript. Endelig vil vi gerne anerkende, Alissa Eckert i kontoret for Associate Director for Kommunikation på CDC for at producere de grafiske illustrationer og Judy Lavelle for at lede alle de Betegnelser i forbindelse med optagelserne af dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
References
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
- Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
- Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
- Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
- Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
- Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
- Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079 (2011).
- Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
- Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
- Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
- Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
- Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
- Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
- Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
- De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
- Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
- Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
- Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
- Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
- Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
- Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
- Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
- How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
- Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
- Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544 (2011).
- Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
- Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
- Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
- Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
- Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).
