Summary
Insamlingen av infekterade fästingar hemolymfa, spottkörtlar och saliv är viktigt att studera hur fästingburen patogener orsaka sjukdom. I detta protokoll visar vi hur man samlar in hemolymfa och spottkörtlar matas
Abstract
Fästingar finns i hela världen och drabbar människor med många fästingburna sjukdomar. Fästingar är vektorer för patogener som orsakar Lyme sjukdom och fästingburen återfallsfeber (Borrelia spp.)., Rocky Mountain spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichios (Ehrlichia chaffeensis och E. equi), anaplasmos (Anaplasma phagocytophilum), encefalit (tick- borne encephalitis virus), babesios (Babesia spp.)., Colorado tick feber (Coltivirus) och tularemi (Francisella tularensis) 1-8. Att bli ordentligt överföras till den mottagande dessa infektiösa agens reglerar differentiellt genuttryck, interagera med tick proteiner och migrerar genom fästingen 3,9-13. Till exempel anpassar Lyme smittämnet, Borrelia burgdorferi, genom ojämn genuttryck för att festen och hungersnöd stadier av fästingens enzootisk cykel 14,15. Dessutom förbrukar som Ixodes tick enblodmjöl Borrelia replikera och migrera från tarmkanalen till hemocoel, där de reser till spottkörtlarna och överförs till värden med ut saliven 9,16-19.
Som en fästing matar värden svarar vanligen med en stark hemostatiska och medfödda immunsvar 11,13,20-22. Trots dessa värdsvar, I. scapularis kan mata flera dagar eftersom fästingen saliv innehåller proteiner som är immunmodulerande, lytiska medel, antikoagulantia och fibrinolysins att hjälpa fästingen utfodring 3,11,20,21,23. De immunmodulerande aktiviteter innehas av tick saliv eller salivkörtelextrakt (SGE) underlätta överföring, spridning och spridning av många fästingburna patogener 3,20,24-27. För att ytterligare förstå hur fästingburen smittämnen orsaka sjukdom är det viktigt att dissekera aktivt utfodring fästingar och samla fästing saliv. Denna video protokoll visar dissekering tekniker förinsamling av hemolymfa och avlägsnande av spottkörtlarna från att aktivt mata I. scapularis nymfer efter 48 och 72 timmar efter mus placering. Vi visar också att saliv samling från en vuxen hona I. scapularis fästing.
Protocol
1. Hemolymfa kollektion för preparatet
(Film 1)
- Försiktigt avlägsna aktivt mata fästingar från ett djur och placera i 3% topisk väteperoxid under 5 minuter och sedan i 70% etanol under 10 minuter till ytan sterilisera.
- Med en pap penna rita en cirkel på ett silan belagd objektglas och placera bocken i pap pennan cirkeln.
- Silan-belagda objektglas användes för bästa vidhäftning av hemolymfa till objektglas.
- Visa fästingen under ett dissektionsmikroskop (1X mål 10X okular, 3,5 X förstoring).
- Tryck försiktigt ner på fästingens dorsum med pincett att sära fästingen ben och immobilisera fästingen.
Obs: När immobilisera fästingen inte trycker för hårt eftersom detta kan störa tarmkanalen eller punktera fästingen och förorena hemolymfa.
- Amputera fästingen ben eller benen på the distal gemensamt med en fin spets disponibel skalpell. För att bestämma smittsamhet via hemolymfa bara 1 ben behöver amputeras. För uppsamling av hemolymfa på en bild flera ben kan amputeras.
Obs: Skär inte benet för nära kroppen eftersom detta kan orsaka midgut förorening av hemolymfa.
- Efter benet eller benen skärs fortsätta att tryck försiktigt på fästingen: s dorsum för hemolymfa att utsöndra ur benen på bilden. Rör försiktigt fästingen runt på bilden för att sprida hemolymfa.
2. Spottkörtel bort
(Filmer 2 & 3)
- Plats flera 25 ^ pooler av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på ett mikroskopglas och placera en fästing in i en av PBS pooler.
- Visa fästingen under ett dissektionsmikroskop (1X mål 10X okular, 3,5 X förstoring).
- Stabilisera fästingen med fin spets tångs genom att hålla grunden capitulum (mundelar) eller baksidan av fästingen.
- Sätt de fina spets pincetten i bakre delen av fästingen och skiva upp fästingen är dorsum att exponera organen. Om så önskas den centrala tarmkanalen kan avlägsnas vid denna tidpunkt och överfördes till en ny grupp av PBS på ett objektglas eller i ett mikrofugrör med PBS.
- Hitta par av spottkörtlarna (grape-liknande kluster) placerade bilateralt tillsammans med benen på fästingen. Om spottkörtlarna inte syns bland de fästingen skräp flytta stora fästingen delen fortfarande innehåller spottkörtlarna, till en ny pool av PBS för att minska störningar och förlust av spottkörtlarna.
Anmärkning: Tidigare i en matning, spottkörtlarna är svårare att lokalisera, eftersom de inte är så utvecklas i jämförelse med senare i matningen.
- Ta bort spottkörtlarna från fästingen med fina spets tång och lägg i en färsk pool av PBS.
- Wie fint tippade pincett överföra spottkörtlarna till en annan ren 25 pl PBS pool, upprepa detta tvättsteget 3-4 gånger för att avlägsna eventuella externa mikroorganismer och fästing skräp.
Notera: Tvätta spottkörtel kluster försiktigt för att minska förlusten och störningar för enskilda spottkörtlar.
- Placera körtlar i en ren pool av PBS på en silan belagda objektglas eller i ett mikrofugrör med PBS.
3. Saliv uppsamling
(Film 4)
- Ta försiktigt bort vuxna kvinnliga fästingar från kanin eller annan värd med fina spets tång precis innan de hoppar av helt och hållet svullna, cirka 5-7 dagar efter bilagor.
- Vidhäfta nästan svullna fästingen på en ände av ett mikroskopobjektglas med tejp. Tejpen bör placeras ungefär ¾ av vägen upp fästingen har dorsum mot huvudet, lämnar fästingen grunden capitulum (mun delar) exponeras.
- Där tejpen möter den främre kanten av fästingar dorsala ytan pipett 5 pl av 5% pilokarpin-lösning (i metanol). Låt bandet att suga av pilokarpin över fästingens dorsum, utan att låta pilokarpin att komma i kontakt med fästingens grund capitulum.
- Montera en bit av icke-toxisk modellera på mikroskop ungefär en tum från fästingens mundelar.
- Användning av fina spets pincett bryta spetsen av en drog kapillärrör 28 till den önskade diametern.
- Visa fästingens grunden capitulum under ett dissektionsmikroskop.
- Försiktigt passa fästingens hypostome in i dragés kapillärröret tillåter att käk palps att uppehålla sig på utsidan av kapillärröret.
- Tryck på motsatta änden av kapillärröret i modelleran att hålla kapillärröret på plats.
- Placera den monterade dregla fästingen inuti en mörk kammare med hög luftfuktighet (t.ex. ett lock frigolitlåda klädd med våta pap Er handdukar). Luta sliden så att hypostome punkter till botten av behållaren, så att tyngdkraften för att hjälpa till i saliv samling.
- Placera behållaren i rumstemperatur.
- Nära övervaka dreglar fästingar under den första timmen, och samla saliv som genereras genom att utvisa det ur kapillärrören med en Pasteur-pipett glödlampa. Efter den första timmen, kolla ackumulering varje timme under minst 4 timmar. Fortsätter att samla upp saliv som den alstras.
Obs: Saliv förvärvet kan avbrytas när tillräckligt med saliv samlas för studien genomförs.
- Om fästingar inte salivating eller om mer saliv krävs kan salivavsöndring ibland induceras genom användning av kapillärröret för att massera hypostome.
- Tillsätt 0,1 volymer proteasinhibitorcocktail till saliven och förvara vid -80 ° C tills de behövdes.
4. Representativa resultat
e_content "> Film 1 visar hur man håller en delvis matas I. scapularis nymf och amputera benen för att samla hemolymfa på ett objektglas. När benet eller benen amputerade en klar vätska utsöndras (figur 1A och 1B). Om midgut bryts den hemolymfa grumlig eftersom det är kommer ut ur amputerade benet (er) (figur 1C och 1D).Utvinning av spottkörtlarna efter nymfen har utfodring i 48 eller 72 timmar visas i filmer 2 och 3. Efter fästing punkteras det i allmänhet en mycket skräp (bestående av trakea, malpighian tubuli, blod, bindväv etc), för att förhindra förlust eller avbrott i spottkörtlarna flytta fästingen att en färsk pool av PBS. Figurerna 2A och 2B visar var spottkörtlarna är belägna efter att nymfen har skurits öppna och Figur 2c visar bort spottkörtel kluster i en pool av PBS.
Saliv kollektionen som upp från I. scapularis vuxna kvinnor i ar visat i filmen 4 och figur 3. En bock dregla i ett kapillärrör observeras i filmen 5. Denna metod för saliv samlingen används för pilokarpin för att stimulera salivering och kan ge över 20 pl saliv per vuxen hona fästing.
Figur 1. Märkta strukturer ett I. scapularis nymf.
Film 1. Ixodes scapularis hemolymfa samling. Klicka här för att se filmen .
Figur 2. Rent (A & B) och förorenad (C & D) hemolymfa utsöndras från nymfen ben.
Film 2. Spottkörtel extraktion från en 48 timmars matas I. scapularis nymf.pload/3894/3894movie2.avi "> Klicka här för att se filmen.
Movie 3. Spottkörtel extraktion från en 72 timmars matas I. scapularis nymf. Klicka här för att se filmen .
Figur 3. Ixodes scapularis nymf spottkörtlar. (A & B) Exempel på spottkörtlarna i en 72 timmars matas nymf, före extraktion. (C) Avlägsnad spottkörtel kluster.
Movie 4. Saliv samling som upp från en vuxen I. scapularis kvinnliga fästing. Klicka här för att se filmen .
Figur 4. Saliv samling från vuxna I. scapularis kvinnliga ticks. (A & B) Tick monterad på en slid med hypostome i den dras änden av kapillärröret med unpulled änden av kapillärröret som innehas av modellera. (C & D) fuktkammare innehåller salivating vuxna I. scapularis kvinnliga fästingar.
Film 5. Ixodes scapularis kvinnliga fästingar dregla i ett kapillärrör. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Insamlingen av fästingen hemolymfa, spottkörtlar och saliv är viktig i studiet av fästingburen patogen överföring, förekomst, spridning, spridning och uthållighet i både fästingen och värden 6,11-13,20,23,29. Det finns flera sätt att dissekera en fästing 30,31. Men när samlar spottkörtlarna är det viktigt att dissekera fästingen ordentligt så spottkörtlarna inte spruckit eller förlorade i fästingen kvarlevor. När väl spottkörtlarna avlägsnas från fästingen de måste tvättas flera gånger för att avlägsna mellantarm kontaminering och sedan kan fästas på en slid för färgning eller malda i PBS för att erhålla salivkörtelextrakt (SGE). SGE är lättare att samla än saliv och besitter egenskaper som liknar saliv, och därför kan det användas som ett alternativ saliv. Innehåller dock SGE ytterligare proteiner som härrör från spottkörtel celler som inte finns i fästing saliv. Tillägget av extra proteiner i SGE kan be en fördel eller en nackdel beroende på vilken studie som utförts, men är något en forskare måste vara medveten om när man arbetar med SGE. SGE inte har den fördelen att pilokarpin inte används under insamlingen av spottkörtlar. Pilokarpin, muskarin en kolinomimetisk medel som verkar som en agonist av räddning, har visats ha en cytotoxisk effekt på B. burgdorferi under saliv uppsamling 32,33. Dopamin är en annan agonist av salivavsöndring men snabbt förstörs av hemolymfa och andra fluider tick, jämfört med pilokarpin som har en fördröjd effekt 33. Andra stimulerande tekniker har undersökts för saliv uppsamling och alla visade sig påverka saliv sammansättningen 34.
Hemolymfa samlingen kan vara svårt eftersom fästingarna rör och det kan vara problematiskt att immobilisera dem utan att brista i midgut. Immobilisera fästingen med dubbelhäftande tejp är ett alternativ, men Hemolymfan kan gå förlorade på bandet om fästingen inte tas bort. Andra studier har samlat hemolymfa från flera fästingar genom att skära tick ben vid distala lederna och använda centrifugering för att samla hemolymfa 16,35. När hemolymfa Samlingen behärskar hemolymfa kan användas för att bestämma tick smittsamhet, Kryssa i för att patogen interaktioner och migrering av patogener från tarmkanalen till spottkörtlarna.
Även om vårt laboratorium fokus ligger på B. burgdorferi och I. scapularis fästingar, de metoder som nämns i detta protokoll kan användas för att studera andra fästingburna smittämnen och bocka arter. Vidare kan dessa tekniker också användas på nymfer eller vuxna med relativ lätthet. Med hjälp av dessa tekniker med larven kan vara en utmaning på grund av sin storlek. Tills dissektion tekniken behärskas föreslås att använda oinfekterade fästingar. Det är också viktigt att ha ordentlig biosäkerhetsågärder när dissekera infektionerTed eller fältet samlas fästingar. De metoder som i den här videon protokoll kan användas som riktlinjer för hur utföra tick dissektioner och vad man ska leta efter när de utför dessa tekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Avdelningen för Vector-Borne Diseases Animal Resources Branch, särskilt Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, och John Liddell för deras vård och underhåll av möss och kaniner. Vi vill också tacka Amy Ullmann, Theresa Russell, och Barbara J. Johnson för deras bidrag mot detta manuskript. Slutligen vill vi tacka för Alissa Eckert i Office för Associate Director för kommunikation vid CDC för att producera grafiska illustrationer och Judy Lavelle för att koppla alla de juridiska i samband med inspelningen av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
References
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
- Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
- Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
- Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
- Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
- Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
- Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079 (2011).
- Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
- Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
- Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
- Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
- Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
- Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
- Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
- De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
- Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
- Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
- Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
- Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
- Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
- Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
- Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
- How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
- Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
- Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544 (2011).
- Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
- Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
- Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
- Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
- Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).
