Summary
Samlingen av infiserte flått hemolymph, spyttkjertlene, og spytt er viktig å studere hvordan tick-borne patogener forårsaker sykdom. I denne protokollen viser vi hvordan samle hemolymph og spyttkjertler fra fôring
Abstract
Flått finnes over hele verden og plage mennesker med mange flåttbårne sykdommer. Flått er vektorer for patogener som forårsaker Lyme sykdom og tick-borne relapsing feber (Borrelia spp.)., Rocky Mountain Spotted feber (Rickettsia rickettsii), ehrlichiose (Ehrlichia chaffeensis og E. konta), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encefalitt (tick- borne encefalitt virus), babesiosis (Babesia spp.)., Colorado tick feber (Coltivirus), og tularemia (Francisella tularensis) 1-8. Å bli ordentlig overføres til verten disse smittestoff differensielt regulere genuttrykket, samhandle med tick proteiner, og vandrer gjennom flåtten 3,9-13. For eksempel tilpasser Lyme sykdommen agent, Borrelia burgdorferi, gjennom differensial genuttrykk til festen og hungersnød stadier av flåtten er enzootic syklus 14,15. Videre forbruker som en Ixodes flåtten enbloodmeal Borrelia replikere og migrere fra midgut i hemocoel, hvor de reiser til spyttkjertlene og overføres til verten med utvist spytt 9,16-19.
Som en hake mater verten reagerer vanligvis med en sterk hemostatic og medfødte immunforsvaret 11,13,20-22. Til tross for desse vert svarene, I. scapularis kan mate i flere dager fordi flåtten spytt inneholder proteiner som er immunmodulerende og lytiske agenter, antikoagulantia og fibrinolysins å hjelpe flåtten fôring 3,11,20,21,23. De immunmodulerende aktiviteter besatt av flått spytt eller spyttkjertel ekstrakt (SGE) lette overføring, spredning, og formidling av en rekke flåttbårne patogener 3,20,24-27. For ytterligere å forstå hvordan tick-borne smittestoffer forårsake sykdom er det viktig å dissekere aktivt fôring flått og samle tick spytt. Denne videoen protokollen viser disseksjon teknikker forinnsamling av hemolymph og fjerning av spyttkjertler fra aktivt fôring I. scapularis nymfer etter 48 og 72 timer etter mus plassering. Vi viser også spytt samling fra en voksen hunn I. scapularis tick.
Protocol
1. Hemolymph kolleksjon for lysbilde forberedelse
(Movie 1)
- Fjern forsiktig aktivt fôring flått fra et dyr og sted i 3% aktuell hydrogenperoksid i 5 minutter og deretter i 70% etanol i 10 minutter til overflaten sterilisere.
- Med en pap penn tegner en sirkel på en silane belagt objektglass og plasser flåtten innen PAP pennen sirkelen.
- Silane belagt lysbilder brukes for beste etterlevelse av hemolymph til objektglass.
- Vis flåtten under et dissekere mikroskop (1X objektiv, 10x okular, 3.5x forstørrelse).
- Trykk forsiktig ned på haken sin dorsum med tang for å spriker flåtten ben og immobilisere flåtten.
Merk: Når immobilizing flåtten ikke trykker for hardt da dette kan forstyrre midgut eller punktering flåtten og forurense hemolymph.
- Amputere flåtten ben eller ben på the distale felles med en fin spiss disponibel skalpell. For å bestemme smittsomhet via hemolymph bare ett ben må amputere. For innsamling av hemolymph på et lysbilde flere strekninger kan bli amputert.
Merk: Ikke kutt beinet for nær kroppen fordi dette kan føre til midgut kontaminering av hemolymph.
- Etter beinet eller beina er kuttet fortsatt press forsiktig på haken sin dorsum for hemolymph å skille ut av bena inn på lysbildet. Forsiktig bevege flåtten rundt på lysbildet for å spre hemolymph.
2. Spyttkjertel fjerning
(Movies 2 & 3)
- Spot flere 25 mL bassenger av fosfat saltløsning (PBS) på et objektglass og plassere en hake i en av PBS bassengene.
- Vis flåtten under et dissekere mikroskop (1X objektiv, 10x okular, 3.5x forstørrelse).
- Stabilisere flåtten med fin tippet forceps ved å holde grunnlag capitulum (munn deler) eller baksiden av flåtten.
- Sett de fine spisser tang inn på baksiden av flåtten og skjær opp flåtten er dorsum å eksponere de organer. Hvis ønskelig at midgut kan fjernes på denne tiden og overført til en ny pool av PBS på et objektglass eller til en microfuge rør som inneholder PBS.
- Finn par spyttkjertler (drue-liknende samlinger) lokalisert bilateralt sammen bena på flåtten. Hvis spyttkjertlene ikke er synlige blant flåtten rusk bevege den viktigste flåtten delen, likevel inneholder spyttkjertlene, til en frisk pool av PBS for å redusere avbrudd og tap av spyttkjertlene.
Merk: Tidligere i en fôring, spyttkjertlene er vanskeligere å finne fordi de ikke er så utviklet som i forhold til senere i fôring.
- Fjern spyttkjertler fra flåtten med fine spisser pinsett og legg dem i en fersk pool av PBS.
- With fin tippet tang overføre spyttkjertlene til annen ren 25 mL PBS basseng, gjenta dette vasketrinn 3-4 flere ganger for å fjerne eventuelle eksterne mikroorganismer og tick rusk.
Merk: Vask spyttkjertel klynger forsiktig for å redusere tap og avbrudd av individuelle spyttkjertlene.
- Plasser kjertler i en ren pool av PBS på en silane belagt lysbilde eller i en microfuge rør som inneholder PBS.
3. Spytt samling
(Movie 4)
- Fjern forsiktig voksen hunn flått fra kanin eller andre verten bruker fine spisser tang like før de faller fra fullt engorged, ca 5-7 dager etter vedlegg.
- Følge den nesten engorged kryss på den ene enden av et objektglass med teip. Tapen bør plasseres omtrent ¾ av veien opp flåtten har dorsum mot hodet, slik at flåtten er grunnlaget capitulum (munn deler) som utsettes.
- Der tape møter den fremre kanten av flått framsiden pipettér 5 mL av 5% pilokarpin løsning (i metanol). La tape til veken i pilokarpin over flåtten i dorsum, uten at det pilokarpin å komme i kontakt med flåtten er grunnlaget capitulum.
- Monter et stykke av ikke-giftig modellering leire på objektglass omtrent en tomme fra flåtten har munndeler.
- Bruker fine spisser tang brekke av tuppen på en trakk kapillarrør 28 til ønsket diameter.
- Se flåtten er grunnlaget capitulum under et dissekere mikroskop.
- Forsiktig passer flåtten har hypostome inn de trakk kapillærrøret tillater overkjevens palps å ligge på utsiden av kapillarrør.
- Trykk den motsatte enden av kapillærrøret i modelleire for å holde kapillærrøret på plass.
- Plasser montert salivating flåtten inne i et mørkt kammer med høy luftfuktighet (f.eks en lokk styrofoam boks foret med våt pap eh håndklær). Vipp lysbildet slik at hypostome poeng til bunnen av beholderen, slik at tyngdekraften til hjelp i spytt samling.
- Plasser beholderen ved romtemperatur.
- Nøye overvåke salivating flått den første timen, og samle spytt som det er generert ved å utvise den ut av kapillærrør med en Pasteur pipette pære. Etter den første timen, sjekk opphopning hver time i minst 4 timer. Fortsett å samle spytt som den er generert.
Merk: Spytt oppkjøpet kan bli stoppet når nok spytt samles for studien utføres.
- Hvis flått ikke salivating eller hvis mer spytt er nødvendig, kan spyttsekresjon og til bli indusert ved hjelp av kapillarrør å massere hypostome.
- Legg til 0,1 volum av proteasehemmer cocktail til spytt og butikken ved -80 ° C inntil nødvendig.
4. Representative Resultater
e_content "> Movie 1 viser hvordan å holde en delvis matet I. scapularis nymfe og amputere beina å samle hemolymph på et objektglass. Når benet eller ben er amputert en klar væske utskilles (figur 1A og 1B). Dersom midgut er ødelagt den hemolymph uklar som det er kommer ut av den amputerte ben (r) (figur 1C og 1D).Utvinning av spyttkjertlene etter nymfen er fôring i 48 eller 72 timer er vist i filmer 2 og 3. Etter at flåtten er punktert det er generelt mye rusk (bestående av luftrøret, malpighian tubuli, blod, bindevev osv.), for å hindre tap eller avbrudd av spyttkjertlene flytte flåtten til en frisk pool av PBS. Tall 2A og 2B viser hvor spyttkjertler befinner etter nymfen har blitt kuttet åpen og Figur 2c viser fjernet spyttkjertel klynger i en dam av PBS.
Spytt samling satt opp fra I. scapularis voksne hunner i s vist i filmen 4 og figur 3. En hake salivating inn en kapillarrør er observert i filmen fem. Denne metoden for spytt samling brukte pilokarpin å stimulere spytt og kan gi over 20 mL av spytt per voksen hunn flått.
Figur 1. Merkede strukturer av en I. scapularis nymfe.
Movie 1. Ixodes scapularis hemolymph samling. Klikk her for å se film .
Figur 2. Forurenset (A & B) og forurenset (C & D) hemolymph væskende fra nymfen ben.
Movie 2. Spyttkjertel utvinning fra en 48 timers matet I. scapularis nymfe.pload/3894/3894movie2.avi "> Klikk her for å se film.
Movie 3. Spyttkjertel utvinning fra en 72 timers matet I. scapularis nymfe. Klikk her for å se film .
Figur 3. Ixodes scapularis Nymph spyttkjertlene. (A & B) Eksempler på spyttkjertler i en 72 timers matet nymfe, før utvinning. (C) Fjernet spyttkjertel klynge.
Movie 4. Spytt samling satt opp fra en voksen I. scapularis kvinnelig tick. Klikk her for å se film .
Figur 4. Spytt samling fra voksen I. scapularis kvinnelige ticks. (A & B) Kryss montert på et lysbilde med sin hypostome i trakk enden av kapillarrør med unpulled enden av kapillærrøret holdt av modelleire. (C & D) fuktet kammeret inneholder salivating voksen I. scapularis kvinnelige flått.
Movie 5. Ixodes scapularis kvinnelig flåtten salivating inn en kapillarrør. Klikk her for å se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samlingen av flått hemolymph, spyttkjertlene, og spytt er viktig i studiet av tick-borne patogen overføring, prevalens, formidling, spredning, og utholdenhet både flåtten og verten 6,11-13,20,23,29. Det er flere måter å dissekere en hake 30,31. Men ved innsamling spyttkjertler det er avgjørende å dissekere flåtten på riktig måte slik spyttkjertlene ikke sprukket eller tapt i flåtten levninger. Når spyttkjertlene fjernes fra flåtten de trenger å vaskes flere ganger for å fjerne midgut forurensning og deretter kan fikses på et lysbilde til farging eller malt i PBS for å få spyttkjertel ekstrakt (SGE). SGE er lettere å samle enn spytt og besitter attributter ligner spytt, og derfor kan den brukes som et spytt alternativ. Imidlertid inneholder SGE ekstra proteiner som stammer fra spyttkjertel celler som ikke er til stede i tick spytt. Tillegg av ekstra proteiner i SGE kan be en fordel eller en ulempe avhengig av studien blir utført, men er noe en forsker må være klar over når du arbeider med SGE. SGE har den fordelen at pilokarpin ikke brukes under samling av spyttkjertlene. Pilocarpine, en muskarin kolinergikum agent som fungerer som en agonist for frelse, har vist seg å ha en cytotoksisk effekt på B. burgdorferi under spytt samling 32,33. Dopamin er et annet agonist av spytt, men blir raskt ødelagt av hemolymph og andre tick væsker, sammenlignet med pilokarpin som har en vedvarende effekt 33. Andre stimuleringstiltak teknikker har blitt undersøkt for spytt innsamling og alle ble vist å påvirke spytt sammensetning 34.
Hemolymph samling kan være vanskelig fordi flått er i bevegelse og det kan være problematisk å immobilisere dem uten sprekker den midgut. Immobilizing flåtten med dobbeltsidig tape er et alternativ, men det hemolymfe kan gå tapt på tape hvis flåtten ikke fjernes. Andre studier har samlet hemolymph fra flere flått ved å kutte tick ben på distale leddene og bruke sentrifugering å samle hemolymph 16,35. Når hemolymph samling er mestret hemolymph kan brukes til å bestemme tick smittsomhet, tick for å patogen interaksjoner, og migrering av patogener fra midgut til spyttkjertlene.
Selv om vårt laboratorium fokus er på B. burgdorferi og I. scapularis flått, de teknikkene som er nevnt i denne protokollen kan brukes til å studere andre flåttbårne smittestoffer og kryss arter. Videre kan disse teknikkene også brukes på nymfer eller voksne med relativ letthet. Bruk av disse teknikkene med larve kan være utfordrende på grunn av sin størrelse. Inntil disseksjon teknikken er mestret det foreslått å bruke friske flått. Det er også viktig å trene riktig biologisk tiltak når dissekere infekted eller feltet samlet flått. Metodene i denne videoen protokollen kan brukes som retningslinjer for hvordan å utføre tick disseksjoner og hva du skal se etter når du utfører disse teknikkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Divisjon for vektorbårne sykdommer Animal Resources Branch, spesielt Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien, og John Liddell for deres pleie og vedlikehold av mus og kaniner. Vi ønsker også å takke Amy Ullmann, Theresa Russell, og Barbara J. Johnson for deres bidrag mot dette manuskriptet. Til slutt ønsker vi å erkjenne Alissa Eckert i kontor Associate Director for kommunikasjon ved CDC for å produsere den grafiske illustrasjoner og Judy Lavelle for å styre alle Betegnelser forbundet med filmingen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H312-500 | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-5000 | |
| PBS | Boston Bioproducts | BM-2205 | |
| Dumont Fine forceps (3C) | Fisher Scientific | NC9906085 | |
| Silane treated microscope slides | Bioworld | 42763007-1 | |
| Pap pen | Bioworld | 21750008-1 | |
| Super frost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| Pilocarpine | Sigma-Aldrich | P6503-5G | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| #11 disposable scalpel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2975#11 | |
| Nontoxic modeling clay | Fisher Scientific | S17307 | |
| Capillary tubes | Chase Scientific Glass, Inc. | 40A502 |
References
- Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. What's eating you? Hyalomma ticks. Cutis. 87, 165-167 (2011).
- Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. Tick-borne illnesses: a CME update. Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).
- Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. Vector-host interactions in disease transmission. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).
- Estrada-Pena, A., Jongejan, F. Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission. Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).
- Nuttall, P. A. Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus. Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).
- Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. Enhancement of virus transmission by tick salivary glands. J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).
- Labuda, M., Nuttall, P. A. Tick-borne viruses. Parasitol. 129, 221-245 (2004).
- Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. Update on tick-borne bacterial diseases in Europe. Parasite. 16, 259-273 (2009).
- Zhang, L., et al. Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph. PLoS Pathog. 7, e1002079 (2011).
- Piesman, J., Schneider, B. S. Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks. Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Tick immunobiology. Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).
- Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo. Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).
- Nuttall, P. A., Labuda, M. Tick-host interactions: saliva-activated transmission. Parasitol. 129, 177-189 (2004).
- Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host. FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).
- Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis. Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).
- Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae). J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).
- Piesman, J. Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi. Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).
- De Silva, A. M., Fikrig, E. Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).
- Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks. Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).
- Brossard, M., Wikel, S. K. Immunology of interactions between ticks and hosts. Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).
- Wikel, S. K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission. Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).
- Binnington, K. C., Kemp, D. H. Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission. Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).
- Guo, X., et al. Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins. Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).
- Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils. Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).
- Lima, C. M., et al. Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut. J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).
- Severinova, J., et al. Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice. Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).
- How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM (2009).
- Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts. Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).
- Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. (48), e2544 (2011).
- Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide. Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).
- Ledin, K. E., et al. Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum. Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).
- Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva? Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).
- Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods. J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).
- Burgdorfer, W. Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).
