Denne artikel beskriver en optimeret sekvens af begivenheder for multimodal billeddannelse af cellulære transplantater i gnaverhjerne med: (i) in vivo bioluminescens og magnetisk resonansimagografi, og (ii) post mortem histologisk analyse. Ved at kombinere disse billeddiagnostiske metoder på et enkelt dyr giver cellulære graft evaluering med høj opløsning, følsomhed og specificitet.
I det sidste årti har stamcelletransplantation vundet stigende interesse som primær eller sekundær terapeutisk modalitet for en række sygdomme, både i prækliniske og kliniske undersøgelser. Men til dato resultater med hensyn til det funktionelle resultat og / eller vævsregeneration følgende stamcelletransplantation er ret forskellige. Generelt er en klinisk fordel observeres uden dybere forståelse af de underliggende mekanisme (r) 1. Derfor har flere indsats førte til udviklingen af forskellige molekylære billeddiagnostiske metoder til at overvåge stamceller podning med det endelige mål at præcist vurdere overlevelse, skæbne og fysiologi af podede stamceller og / eller deres mikro-miljø. Observerede ændringer i en eller flere parametre bestemmes ved molekylær billeddannelse kan være relateret til den observerede kliniske effekt. I denne sammenhæng fokusere vores undersøgelser på kombineret anvendelse af bioluminescens imaging (BLI), magnetisk resonans imaging (MRI) og histologiske analysis vurdere stamcelle podning.
BLI er almindeligt anvendt til ikke-invasivt at udføre cellesporing og overvåge celleoverlevelse i tid efter transplantation 2-7, baseret på en biokemisk reaktion, hvor celler, der udtrykker luciferase-reportergenet, er i stand til at udsende lys efter interaktion med dets substrat (fx D- luciferin) 8, 9. MRI på den anden side er en ikke-invasiv teknik, som er klinisk relevant 10 og kan anvendes til præcist at lokalisere cellulære transplantater med meget høj opløsning 11-15, selv om dens følsomhed afhænger i høj grad kontrast genereret efter cellemærkning med et MRI-kontrastmiddel . Endelig post mortem histologisk analyse er den foretrukne fremgangsmåde til validering forskningsresultater opnået med ikke-invasive teknikker med den højeste opløsning og følsomhed. Endvidere endepunkt histologisk analyse gør det muligt at udføre detaljeret fænotypisk analyse af podede celler og / eller det omgivende væv, baSED om brugen af fluorescerende reporter-proteiner og / eller direkte cellemærkning med specifikke antistoffer.
Sammenfattende, her er vi visuelt påvise komplementariteten af BLI, MRI og histologi at udrede forskellige stamcelle-og / eller miljø-associerede egenskaber som følge stamceller podning i centralnervesystemet hos mus. Som et eksempel marv-afledte knogle stromaceller, genetisk manipuleret til at udtrykke forøget Green Fluorescent Protein (EGFP) og ildflueluciferase (udsving), og mærkes med fluorescerende blå mikrometerstore jernoxidpartikler (MPIOs) vil blive podet på CNS af immun-kompetente mus, og resultaterne vil blive overvåget af BLI, MRI og histologi (figur 1).
I denne rapport beskriver vi en optimeret protokol til en kombination af tre komplementære billeddiagnostiske metoder (BLI, MRI og histologi) for detaljeret karakterisering af cellulære implantater i CNS i immunkompetente mus. En kombination af reportergen mærkning af celler, baseret på genetisk modifikation med reportergener ildflueluciferase og EGFP og en direkte cellemærkning med GB MPIO, fører til en nøjagtig vurdering af stamceller transplantater in vivo.
For partikel m?…
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
PBS | Gibco | 14190 | |
Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
trypsin | Gibco | 25300 | |
GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
D-luciferin | Promega | E1601 | |
Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
0.9% NaCl solution | Baxter | ||
paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
sucrose | Applichem | A1125 | |
Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
Photon imager | Biospace Lab | ||
9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
syringe | Hamilton | 7635-01 | |
30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
Photo Vision software | Biospace Lab | ||
M3vision software | Biospace Lab | ||
Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
Amira 4.0 software | Visage Imaging |