Summary

Multimodal Imaging van Stem Cell implantatie in het centrale zenuwstelsel van Muizen

Published: June 13, 2012
doi:

Summary

Dit artikel beschrijft een optimale volgorde van de gebeurtenissen voor de multimodale beeldvorming van cellulaire grafts in knaagdier hersenen met behulp van: (i) in vivo bioluminescentie en magnetische resonantie beeldvorming, en (ii) post mortem histologische analyse. De combinatie van deze beeldvorming op een enkel dier laat cellulaire graft evaluatie met een hoge resolutie en gevoeligheid en specificiteit.

Abstract

In de afgelopen tien jaar heeft stamceltransplantatie kreeg steeds meer interesse als primaire of secundaire therapeutische modaliteit voor een verscheidenheid van ziekten, zowel in de preklinische en klinische studies. Echter, tot op heden de resultaten met betrekking tot functioneel resultaat en / of weefsel regeneratie volgende stamceltransplantatie zijn zeer divers. Over het algemeen wordt een klinisch voordeel waargenomen, zonder diepgaande kennis van het onderliggende mechanisme (s) 1. Daarom hebben meerdere inspanningen geleid tot de ontwikkeling van verschillende moleculaire beeldvormende technieken om stamcellen enten met het uiteindelijke doel om nauwkeurig te evalueren overleven, het lot en de fysiologie van geënte stamcellen en / of hun micro-omgeving te bewaken. Veranderingen waargenomen in een of meer parameters bepaald door moleculaire beeldvorming kan worden gerelateerd aan de waargenomen klinisch effect. In deze context, onze studies richten zich op het gecombineerd gebruik van bioluminescentie (BLI), magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en histologische analysis om stamcel transplantatie te beoordelen.

BLI wordt vaak gebruikt om niet-invasief te voeren cel volgen en te controleren overleving van de cel in de tijd na de transplantatie 2-7, op basis van een biochemische reactie waarbij cellen die de Luciferase-reporter-gen in staat zijn om licht volgende interactie uit te stoten met zijn substraat (bijv. D- luciferine) 8, 9. MRI anderzijds een niet-invasieve techniek die klinisch toepassing 10 en kan worden gebruikt om nauwkeurig cellulaire grafts lokaliseren met zeer hoge resolutie 11-15 hoewel de gevoeligheid sterk afhankelijk van het contrast gegenereerd na labeling cel met een MRI contrastmiddel . Tot slot, post-mortem histologische analyse is de methode bij uitstek om onderzoeksresultaten verkregen met niet-invasieve technieken met de hoogste resolutie en gevoeligheid te valideren. Bovendien eindpunt histologische analyse laat ons toe om uit te voeren gedetailleerde fenotypische analyse van geënte cellen en / of het omliggende weefsel, based op het gebruik van fluorescerende reporter eiwitten en / of direct cel labeling met specifieke antilichamen.

Samenvattend kunnen we hier visueel tonen de complementariteit van BLI, MRI en histologie aan verschillende stamcel-en / of milieu-gerelateerde kenmerken na stamcel transplantatie in het CZS van muizen te ontrafelen. Als voorbeeld beenmerg-afgeleide stromacellen, genetisch gemanipuleerd om de versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) en vuurvlieg luciferase (fluctuaties), en voorzien van blauw fluorescerende microscopisch kleine ijzeroxide deeltjes (MPIOs) drukken, worden geënt in de CNS van immuun-competente muizen en het resultaat zal worden gecontroleerd door BLI, MRI en histologie (figuur 1).

Protocol

1. Celpreparaat Experimenten dient te worden gestart met behulp van ex vivo gekweekte stamcellen populaties genetisch gemanipuleerd om de Luciferase en eGFP reporter eiwitten uit te drukken. Hier gebruikt Luciferase / EGFP-expressie muizen beenmerg-afgeleide stromacellen (BMSC-Luc/eGFP) zoals eerder beschreven door Bergwerf et al.. 2, 5. Twee dagen voor cel etikettering plaat BMSC-Luc/eGFP cellen een dichtheid van 8 x 10 5 cellen per T75 fles cultuur in 15 ml compleet …

Discussion

In dit rapport beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor de combinatie van drie elkaar aanvullende beeldvormende technieken (BLI, MRI en histologie) voor gedetailleerde karakterisering van cellulaire implantaten in het CZS van immuun-competente muizen. Een combinatie van reportergen etikettering van de cellen, op basis van genetische modificatie met de reporter genen Firefly luciferase en eGFP, en een direct cel etikettering met GB MPIO, leidt tot een nauwkeurige beoordeling van de stamcellen grafts in vivo.<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> De auteurs werk werd ondersteund door onderzoek te verlenen ID-BOF 2006 van de Universiteit Antwerpen (toegekend aan PPO en AVdL), door onderzoek te verlenen G.0136.11 en G.0130.11 (toegekend aan AVdL, ZB en PPO) en 1.5.021.09. N.00 (toegekend aan PPO) van het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen (FWO-Vlaanderen, België), door de SBO onderzoek te verlenen IWT-60838: BRAINSTIM van het Vlaams Instituut voor Wetenschap en Technologie (toegekend aan ZB en AVDL), in deels door een Methusalem onderzoek subsidie ​​van de Vlaamse overheid (toegekend aan ZB), deels door EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005 tot 512146), EG-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004 tot +503.569) , en door de Inter University Attraction Poles IUAP-NIMI-P6/38 (toegekend aan AVDL). Nathalie De Vocht heeft een PhD-stipendium van het FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts is een post-doctoraal onderzoeker van het FWO-Vlaanderen.</p

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
IMDM Lonza BE12-722F Component of the cell growth medium CEM
Fetal bovine serum Gibco 10270-106 Component of the cell growth medium CEM
Horse serum Gibco 1605-122 Component of the cell growth medium CEM
Penicillin-streptomycin Gibco 15140 Component of the cell growth medium CEM
Fungizone Gibco 15290-018 Component of the cell growth medium CEM
PBS Gibco 14190  
Puromycine Invivogen ant-pr-1  
trypsin Gibco 25300  
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833  
D-luciferin Promega E1601  
Ketamine (Ketalar) Pfizer    
Xylazine (Rompun) Bayer Health care    
Isoflurane Isoflo 05260-05  
0.9% NaCl solution Baxter    
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000  
sucrose Applichem A1125  
Micro-injection pump KD scientific KDS100  
Photon imager Biospace Lab    
9.4T MR scanner Bruker Biospin Biospec 94/20 USR  
BX51 microscope Olympus BX51  
Mycrom HM cryostat Prosan HM525  
syringe Hamilton 7635-01  
30 gauge needle Hamilton 7762-03  
Photo Vision software Biospace Lab    
M3vision software Biospace Lab    
Paravision 5.1 software Bruker Biospin    
Amira 4.0 software Visage Imaging    

References

  1. Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. . Molecular imaging of stem cells. , (2008).
  2. Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
  3. Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain’s innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
  4. Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
  5. De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
  6. Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
  7. Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
  8. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
  9. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
  10. Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
  11. Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
  12. Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
  13. Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
  14. Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
  15. Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
  16. Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
  17. Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
  18. Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
  19. Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
  20. Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
  21. Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
  22. Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
  23. Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
  24. Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
  25. Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
  26. Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
  27. Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
  28. Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
  29. Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
  30. Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).

Play Video

Cite This Article
De Vocht, N., Reekmans, K., Bergwerf, I., Praet, J., Hoornaert, C., Le Blon, D., Daans, J., Berneman, Z., Van der Linden, A., Ponsaerts, P. Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice. J. Vis. Exp. (64), e3906, doi:10.3791/3906 (2012).

View Video