Multimodal Imaging av stamceller implanteras i centrala nervsystemet hos möss
Summary
Den här artikeln beskriver en optimerad sekvens av händelser för multimodal avbildning av cellulära transplantat i gnagare hjärnan med hjälp av: (i) in vivo mareld och magnetisk resonanstomografi, och (ii) post mortem histologisk analys. Genom att kombinera dessa avbildningsmetoder för ett enskilt djur kan cellulär transplantat utvärdering med hög upplösning, känslighet och specificitet.
Abstract
Under det senaste decenniet har stamcellstransplantation fått allt större intresse som primär eller sekundär terapeutisk modalitet för olika sjukdomar, både i prekliniska och kliniska studier. Hittills har dock resultat när det gäller funktionella resultat och / eller vävnadsregenerering efter stamcellstransplantation är ganska olika. Generellt är en klinisk nytta observeras utan en djupgående förståelse av de underliggande mekanism (er) 1. Därför har flera försök lett till utvecklingen av olika molekylära avbildningsmetoder för att övervaka stamcellsforskningen ympning med det slutgiltiga målet att korrekt värdera överlevnad, öde och fysiologi transplanterade stamceller och / eller deras mikro-miljö. Förändringar som observerats i en eller flera parametrar som bestäms av molekylär avbildning kan vara relaterat till den observerade kliniska effekten. I detta sammanhang våra studier fokuserar på den kombinerade användningen av bioluminiscens imaging (BLI), magnetisk resonanstomografi (MRT) och histologiska analysiar för att utvärdera stamceller ympning.
BLI används allmänt för att icke-invasivt utföra cell-spårning och övervakning av cellöverlevnad i tid efter transplantation 2-7, baserat på en biokemisk reaktion, där celler som uttrycker luciferas-reportergenen kan emittera ljus efter interaktion med dess substrat (t.ex. D- luciferin) 8, 9. MRT å andra sidan är en icke-invasiv teknik som är kliniskt användbar 10 och kan användas för att exakt lokalisera cellulära transplantat med mycket hög upplösning 11-15, även om dess känslighet höggradigt beroende av kontrast alstras efter cellmärkning med en MRI-kontrastmedel . Slutligen är post-mortem histologisk analys metoden för valet att validera forskningsresultat som erhållits med icke-invasiva metoder med högsta upplösning och känslighet. Dessutom slutpunkt histologisk analys tillåter oss att utföra detaljerade fenotypisk analys av transplanterade celler och / eller omgivande vävnad, based om användningen av fluorescerande reporter proteiner och / eller direkt cell märkning med specifika antikroppar.
Sammanfattningsvis, vi här visuellt demonstrera kompletterar varandra BLI, MRI och histologi att nysta upp olika stamceller-och / eller miljö-associerad egenskaper efter stamceller transplantation i CNS hos möss. Som ett exempel, märghärstammande ben stromaceller, genetiskt manipulerade för att uttrycka den förstärkta grönfluorescerande protein (EGFP) och eldflugeluciferas (fluktuationer), och märktes med blå fluorescerande mikrometerstorlek järnoxid (MPIOs), kommer att ympas i CNS hos immunkompetenta möss och resultatet kommer att övervakas av BLI, MRI och histologi (figur 1).
Protocol
Discussion
I denna rapport beskriver vi en optimerad protokoll för en kombination av tre kompletterande avbildningsmetoder (BLI, MRI och histologi) för detaljerad karakterisering av cellulära implantat i CNS hos immunkompetenta möss. En kombination av reportergenen märkning av celler, baserat på genetisk modifiering med reportergener eldflugeluciferas och EGFP och en direkt cellmärkning med GB MPIO, leder till en korrekt bedömning av transplantat stamceller in vivo.
För partikel märk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
References
- Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. . Molecular imaging of stem cells. , (2008).
- Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice. BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).
- Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. Recognition of cellular implants by the brain’s innate immune system. Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).
- Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS. J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).
- De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo. Mol Imaging Biol. , (2011).
- Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research. Stem Cell Rev. , (2011).
- Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice. Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).
- Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).
- Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. MR tracking of stem cells in living recipients. Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).
- Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat. 17, 1282-1291 (2009).
- Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain. Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).
- Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).
- Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).
- Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study. Neuroimage. 21, 311-317 (2004).
- Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).
- Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents. Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).
- Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. Cellular MR imaging. Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).
- Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells. Blood. 102, 867-872 (2003).
- Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. In vivo detection of single cells by MRI. Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).
- Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).
- Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype. Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).
- Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses. Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).
- Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging. Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).
- Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).
- Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging. Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).
- Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector. Gene. 194, 115-123 (1997).
- Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87. Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).
- Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging. FASEB J. 20, 106-108 (2006).
- Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy. Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).
