Nanodiscs הם חלקיקי discoid קטנים המשלבים חלבונים בממברנה לתיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. אנו מספקים פרוטוקול חזותי המציג את שילוב צעד אחר הצעד של טרנספורטר MalFGK2 לתוך דיסק.
Nanodisc הוא חלקיק discoidal (~ 10-12 ננומטר גדול) שחלבוני קרום מלכודת תיקון קטן של bilayer פוספוליפידים. Nanodisc היא אופציה אטרקטיבית במיוחד ללימוד חלבונים בממברנה, במיוחד בהקשר של יחסי גומלין יגנד לרצפטור. השיטה החלוצית שSligar ועמיתים מתבססים על המאפיינים של amphipathic מהונדס מאוד סליל חלבון פיגום נגזר מאפוליפופרוטאין A1. הפנים ההידרופובי של חלבון פיגום אינטראקציה עם רשתות הלוואי acyl השומן של bilayer השומנים ואילו אזורי הקוטב להתמודד בסביבה המימית. אנליזות של חלבוני קרום בnanodiscs יש יתרונות משמעותיים על פני יפוזום מפני החלקיקים קטנים, הומוגנית ומסיסים במים. בנוסף, שיטות ביוכימיות וbiophysical השמורים בדרך כלל לחלבונים מסיסים יכולות להיות מיושם, ומשני הצדדים של הקרום. בפרוטוקול החזותי הזה, אנו מציגים כינון מחדש צעד אחר צעד וגם characטרנספורטר terized חיידקי ABC, 2 המורכב גברי MalFGK. ההיווצרות של הדיסק היא תהליך הרכבה עצמית שתלוי באינטראקציות הידרופוביות המתרחשות במהלך ההסרה ההדרגתית של חומר הניקוי. אנו מתארים את הצעדים החיוניים ואנו מדגישים את החשיבות של בחירה נכון יחס חלבון לשומנים בדם, במטרה לצמצם את ההיווצרות של אגרגטים וחלקיקים גדולים יותר polydisperse יפוזום דמויים. איכות פשוט שולטת כגון כרומטוגרפיה ג'ל סינון, ג'ל אלקטרופורזה יליד וספקטרוסקופיה פיזור האור דינאמי להבטיח כי את הדיסקים כבר מחדש כראוי.
אנו מתארים הליך פשוט לכינון מחדש של טרנספורטר מלטוז לnanodiscs. טרנספורטר הוא ATPase הפעיל והאינטראקציה עם זכר השותף מחייב המסיס ניתן ליצור מחדש (איור 3). הכינון מחדש המוצלח של טרנספורטר לnanodiscs לפתוח את הדרך לניתוח biophysical וביוכימיים נוספים. מעניין במיוחד יהיה הניתוח…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות. CSC מומן על ידי מלגת דוקטורט ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה. FD היא קנדה מחקר קתדרה משנית.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|