Шаг за шагом метод для разведения Transporter ABC в Nanodisc липидных частиц

Summary

Nanodiscs малых дисковидные частицы, которые включают мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Мы предоставляем визуальный протокол, который показывает, шаг за шагом включения MalFGK2 транспортера на диск.

Abstract

Nanodisc является дисковидные частицы (~ 10-12 нм большой), что ловушка мембранных белков в небольшой патч фосфолипидного бислоя. Nanodisc является особенно привлекательным вариантом для исследования мембранных белков, особенно в контексте лиганд-рецепторных взаимодействий. Метод пионером Sligar и коллегами основана на амфипатическими свойства разработаны высоко-спиральной эшафот белок, полученный из аполипопротеина A1. Гидрофобные лица белка эшафот взаимодействовать с ацил боковых цепей липидного бислоя в то время как полярные регионы сталкиваются с водной средой. Анализы мембранных белков в nanodiscs имеют значительные преимущества по сравнению с липосомами, поскольку частицы мелкие, однородные и растворимые в воде. Кроме того, биохимических и биофизических методов обычно зарезервированы для растворимых белков могут быть применены, и по обе стороны от мембраны. В этой визуальной протокол, мы представляем шаг за шагом, восстановление и характеристикиризуется бактериальных транспортеров ABC, мужчины MalFGK ₂ комплекса. Формирование диска процесса самосборки, что зависит от гидрофобных взаимодействий, происходящих в ходе постепенного устранения моющего средства. Мы опишем основные шаги, и мы подчеркиваем важность выбора правильного белок-липидного соотношения для того, чтобы ограничить образование агрегатов и больше полидисперсных липосомы частицы. Простой контроля качества, такие как гель-фильтрации хроматографии, родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света убедиться, что диски были должным образом восстановлена.

Protocol

Общий процесс разведения

Начнется процесс восстановления путем смешивания мембраны эшафот белка (MSP) с очищенной MalFGK ₂ комплекса в присутствии детергента солюбилизированной фосфолипидов. Этот шаг последующим медленным удаления моющего средства по адсорбента материала полистирола называется Bio-Beads или Amberlite (рис. 1). Автоматический процесс сборки происходит, скорее всего, из-за аполярная взаимодействия между гидрофобными фосфолипидов, MalFGK ₂ комплекса и поверхности MSP амфипатическими белка. Конечный продукт представляет собой дисковидные частицы состоят из двух молекул упаковки MSP вокруг MalFGK ₂ комплекса. Частицы отделяются от аддуктов и агрегатов ультра-центрифугирования и аналитической гель-хроматографии. Частицы характеризуются родной-гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света.

Название "> 1. Подготовка мембранных белков леса, MSP

1. Его с метками MSP (версия MSP1D1 ¹⁾ производится из плазмиды pMSP1D1 в E. палочки BL21 (DE3), индуцированного на OD ₆₀₀ ~ 0,5 с 0,5 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозид в течение 3 часов при 37 ° C.
2. Клетки собирают центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и ресуспендировали в TSG10 буфера, содержащего 100 мкМ phenylmethanesulfonyl фтора.
3. Клетки лизируют с французской прессы (3x) в 8000 фунтов на квадратный дюйм и нерастворимые вещества удаляют центрифугированием при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° C. Растворимые фракции, содержащей MSP выделяют ультра-центрифугирования при 125000 х г в течение 45 мин.
4. MSP очищают никель-хелатирующей хроматографии с использованием ~ 1,5 мл Ni сефарозой HP в TSG10 буфера. Загрязняющие вещества вымываются с TSG10 буфера, содержащего 50 мМ имидазола. MSP элюируют TSG10 буфера, содержащего 600 мМимидазола. Очищенный белок диализовали в TSG10 буфер и хранится в -70 ° С при концентрации белка ~ 10-15 мг / мл.

2. Подготовка MalFGK ₂ комплекс

1. MalFGK ₂ комплекса, его метками на С-конце Malk, выражается из плазмиды pBAD22-FGK в E. палочки BL21 (DE3) и индуцированные на OD ₆₀₀ ~ 0,5 с 0,2% L-арабинозы в течение 3 часов при 37 ° C.
2. После лизиса клеток и центрифугирования, как в пункте 1.3, мембраны осадок ресуспендируют в TSG20 буфера при конечной концентрации 5 мг / мл. Материал растворяется с 1% в / о N-додецил-β-maltopyranoside (DDM) в течение 3 ч при 4 ° С при осторожном встряхивании.
3. Нерастворимый материал удаляется с помощью ультра-центрифугирования, как и в шаге 1.3 и супернатант, содержащий солюбилизированной MalFGK ₂ комплекса собирают и очищают, как в пункте 1.4, но без диализа.
4. FurtheГ очистка достигается путем гель-фильтрации в TSGD буфера на Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,5 мл / мин.

3. Подготовка Фосфолипиды

1. E. палочки общего липидного экстракта растворяют в хлороформе отделяется в 1000 нмоль аликвоты в пробирках винтовой крышкой отцентрифугировать. Растворитель выпаривают при слабой струей азота и сушат дальнейшее течение ночи в вакуумном эксикаторе.
2. Липидную пленку растворяли в буфере TS на 5 нМ конечной концентрации и встряхивали энергично и ультразвуком. Растворяют липиды появится слегка матовой из-за их общей неразрешимости в водном буфере TS, но они должны оставаться во взвешенном состоянии. DDM добавляют до конечной концентрации 0,5% (~ 10 мм), при которой раствор становится прозрачным.
3. Липидов смесь помещают на водяную баню и пульс обрабатывали ультразвуком в течение 5 раз за 5 сек. Липидную смесь хранится при температуре 4 ° С в течение максимум 1 крошечныйк.

4. Подготовка Bio-Beads

1. Примерно 10-15 мл (объем сухого) Bio-Beads помещают в 50 мл трубки.
2. Бисер последовательно промывали 50 мл 100% метанола, 95% этанола, MilliQ H ₂ O, и, наконец, TS буфера (два раза).
3. Промытый бисером хранятся при температуре 4 ° C в ~ 10 мл буфера TS.

5. Восстановление Nanodisc

1. MSP разводят в TSGD буфера при конечной концентрации ~ 7 мг / мл (~ 0,3 мм).
2. ~ 2 нмоль очищенного MalFGK ₂ комплекса смешивают при белка: MSP: липидный отношение 1:3:60 или 1:3:400 в TSGD буфера. Конечная концентрация составляет 6 мкм MalFGK _2, 18 мкМ MSP и 360 мкМ липидов (1:3:60) или 2,4 ммоль липидов (1:3:400). Конечный объем составляет 300 мкл. Конечная концентрация DDM составляет 0,08% (~ 1,6 мм). Конечная концентрация глицерина зависит от количества липидов добавил, но остается около 5-10% V / v ~ 50 мкл Bio-Bead суспензии добавляют в пробирку, и смесь инкубировали в течение ночи на качающейся таблицы при 4 ° C.
3. Бисер осаждают тяжести и решения пипеткой через узкий наконечник, чтобы избегать, насколько Bio-Beads насколько это возможно.
4. Большая осадка удаляются ультра-центрифугирования при 100000 х г в течение 20 мин. Диски очищают с помощью гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера. Фракции, содержащие диски объединяются и аликвоты должны закачиваться на той же колонке гель-фильтрации для проверки стабильности препарата.
5. Очищенные диски могут храниться при -70 ° C в течение длительного периода времени. После оттаивания на льду, диски должны быть подвергнуты ультра-центрифугирования, как и в шаге от 5,5 до устранения потенциальных осадков. Аликвоты должны быть проанализированы гель-фильтрации, чтобы гарантировать, что значительная агрегация или осадки не происходят во время оттаиванияпроцесса.

6. Родные гель-электрофореза

1. 1 мкМ nanodiscs (~ 0,2 мг / мл) анализируют родной стр. ^{6, 7} (Трис-HCl, рН 8,8, 4-12%) для оценки качества восстановления (рис. 3А).
2. Связывание мужчин (1 мкМ) в MalFGK _{2-комплекса} воссоздана в nanodiscs также оценивается по родным-PAGE (рис. 3А).
3. После электрофореза гель окрашивали кумасси синим в течение 10 мин, и обесцвечивают в течение ~ 1 часа.

7. Динамического рассеяния света (DLS)

1. Nanodiscs очищают гель-фильтрации, как в пункте 2.4 в TSG10 буфера, используя Superdex 200 HR 10/300 столбцов при скорости потока 0,1 мл / мин. Фракции, содержащие nanodiscs объединяют и концентрируют до ~ 10 мг / мл с Amicon центробежного фильтра.
2. Образец фильтруют дважды (0,22 мкм) до анализа DLS использованияDynapro nanostar инструмента (Wyatt Technology) в 1 мкл внутреннего объема кварцевых кювет. Данные устанавливается с помощью динамика программного обеспечения (Wyatt Technology) для оценки диаметра и молекулярной массы частиц.

8. АТФазы Измерения

1. АТФазы MalFGK _{2-восстановленного} nanodiscs определяется с использованием колориметрического анализа ^8.
2. 1 мкМ очищенных дисков и 1 мМ ATP смешивают с увеличением количества мужчин и инкубировали при 37 ° С в течение 20 мин. Освобождение неорганического фосфата измеряется при 660 нм.
3. Количество высвобожденного фосфата по сравнению с стандартной кривой, полученной с раствором Стандартный фосфора.

9. Представитель Результаты

Nanodiscs очищают гель-фильтрации хроматографии (рис. 2А, слева). Хроматограмма показывает, что большинство из восстановленного DISCS (черный след) элюируются как единый пик, в то время как диски сделаны с избытком липидов (красный след) элюируются в свободном объеме и в серии широких пиков. Качество nanodiscs далее анализируются родной гель-электрофореза и спектроскопии динамического рассеяния света (DLS). Правильно восстановленный диск миграцию как резкое полосы на геле в то время как те, восстановленный в присутствии избытка липидов мигрировать в мазке (рис. 2A, справа). Анализ показывает, что DLS диск население является однородным со средним диаметром 11,4 нм (рис. 2В). Восстановленные диски имеют молекулярную массу в 215 кДа на основе приближения DLS. Образцы воссоздана в присутствии избытка липидов дисплей широко распространены радиусы около 100 нм, что характерно для неоднородных образцов.

Качество MalFGK ₂ комплекса оценивается по родным-гель-электрофореза и его деятельность АТФазыизмерений (рис. 3). Мальтоза обязательной мужской белок связывается с высоким сродством к MalFGK ₂ транспортера ^{9, 10.} Использование неденатурирующем гель-электрофореза, можно обнаружить сложную между мужчиной и MalFGK ₂ (рис. 3А). Стимулирование Malk ₂ АТФазы мужского показано на рисунке 3b.

Рисунок 1. Типичная схема для восстановления протокола.

Рисунок 2. Контроль качества nanodisc подготовки. A. Гель-фильтрация анализа (Superdex 200 HR 10/300 столбца) nanodiscs восстановленные при низком соотношении липидов (1/3/60, черный след) или высоким соотношением липидов (1/3/400, красный след). Родные гель-электрофореза одного и того же препарата диска. Молecular маркеров вес в кДа указаны. В. Динамические рассеяния света анализа одного и того же препарата диска. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 3. Анализ MalFGK _2-nanodisc частиц. A. Гель сдвиг анализ мужской инкубировали с увеличением количества MalFGK _2-nanodisc частиц. B. АТФазы MalFGK _2-nanodisc частиц как функция мужчины концентрации.

Discussion

Мы опишем простую процедуру для разведения мальтоза транспортера в nanodiscs. Транспортер АТФазы активного и взаимодействия с растворимым обязательного партнера-мужчины могут быть воссозданы (рис. 3). Успешное восстановление транспортера в nanodiscs открыть путь для дополнительного биофизических и биохимических исследований. Особый интерес будут представлять систематический анализ Malk АТФазы и мальтозу транспортной деятельности в производстве моющих средств, липосомы и nanodiscs. ABC транспортеров изменения конформации во время перевозки цикла, но вклад этих липидов конформационных изменений еще предстоит изучить.

Изготовление nanodisc является относительно простым, но небольшие отклонения от оптимальных условий может привести к необратимой агрегации белков. В этом докладе мы подчеркиваем важность выбора правильного белка: соотношение липидов, потому что избыточное количество жиров приведет к блузочныеп большое полидисперсных липосомы, как частицы, которые не реагируют на биофизические квалификации nanodisc. Предыдущий анализ используется очень высокое MSP: соотношение липидов для разведения мальтоза транспортера (1/120 по сравнению до 1/20 в нашем анализе), но частицы, образовавшиеся не отличающиеся ^11. В любом случае, очень важно тщательно проанализировать качество восстановленного материала с использованием иных методов, чем гель-фильтрации, такие как спектроскопия рассеяния света, аналитические ультрацентрифугирования или, проще говоря, родной гель-электрофореза. Важность этого контроля качества была подчеркнута во время воссоздания бактериородопсина и Р-гликопротеина ^12. Два других параметра может существенно повлиять на успех восстановления: 1) чистота мембранного белка мишени и отсутствие агрегатов и 2) правильное соотношение белков мембраны и леса белка. Кроме того, тип фосфолипидов включены яNto диске, а также длины мембранного белка эшафот, может внести вклад в эффективность восстановления. Другие параметры, такие как растворимость и стабильность мембранных белков в растворе моющего средства, буферной системы, температуры и времени длиной восстановления может также должны быть скорректированы при оптимизации восстановления протокола. Например, мембранные белки леса различной длины производят nanodiscs разных размеров ^1, который может помочь восстановлению больших мембранных белковых комплексов или олигомеров мембранных белков.

Nanodisc успешно сочетается с биофизические методы, такие SPR, ЦМТ, и флуоресцентной спектроскопии ^12-16, чтобы помочь мембранных исследований, которые борются с количественной методологии. В последнее время nanodisc была объединена с количественной масс-спектрометрии, чтобы помочь выявлению интерактомов мембранных белков с лучшим охватом и точностью17. Фармацевтическая промышленность была ограничена одними и теми же трудностями, которые мешают научного изучения мембранных белков, хотя это тем, что наиболее часто назначаемых препаратов целевого мембранные белки (рецепторы, каналы, транспортеры, датчики). Можно предсказать, что nanodisc будет способствовать развитию скрининга препаратов стратегии, которые работают с мембраной встроенных белков.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.