Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。
nanodiscは、円盤状の粒子(〜10月12日NM大)リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド – 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK 2複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。
我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が( 図3)再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポ?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、保健研究のカナダの研究所によってサポートされていました。 CSCは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクによって賄われていた。 FDはティアIIカナダリサーチチェアです。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|