A Step-by-step Metode for Rekonstituering av en ABC Transporter inn Nanodisc lipidpartikler

Summary

Nanodiscs er små discoid partikler som inneholder membran proteiner i en liten oppdatering av fosfolipid bilayer. Vi tilbyr en visuell protokoll som viser trinn-for-trinn innlemmelse av MalFGK2 transporter inn en plate.

Abstract

Den nanodisc er en skiveformede partikkel (~ 10-12 nm store) som felle membran proteiner i en liten oppdatering av fosfolipid bilayer. Den nanodisc er et spesielt attraktivt alternativ for å studere membran proteiner, spesielt i sammenheng av ligand-reseptor interaksjoner. Metoden utviklet av Sligar og kolleger er basert på amfipatiske egenskapene til en konstruert svært en-helical scaffoldprotein avledet fra apolipoprotein A1. De hydrofobe ansikter av scaffoldprotein samhandle med fettsyreasylgrupper side-kjeder av lipid bilayer mens polarområdene ansikt vandige miljø. Analyser av membran proteiner i nanodiscs har betydelige fordeler fremfor liposom fordi partiklene er små, homogen og vannoppløselig. I tillegg kan biokjemiske og biofysiske metoder normalt reservert til løselige proteiner bli brukt, og fra begge sider av membranen. I denne visuelle protokollen, presenterer vi en steg-for-steg omdanning av et godt karakteriserte d bakteriell ABC transportør, den mannlige-MalFGK ₂ kompleks. Dannelsen av platen er en selv-oppsettingen som avhenger hydrofobe interaksjoner finner sted under den progressive fjerning av vaskemiddel. Vi beskriver de grunnleggende trinnene og vi markere betydningen av å velge en riktig protein-til-lipid forholdet for å begrense dannelsen av aggregater og større polydisperse liposom-lignende partikler. Enkelt kvalitetskontroller eksempel gelfiltrering kromatografi, innfødt gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi sikre at platene har blitt riktig rekonstituert.

Protocol

Samlet Rekonstituering Process

Tilberedning Prosessen starter ved å blande membranen scaffoldprotein (MSP) med rensede MalFGK ₂ kompleks i nærvær av vaskemiddel-solubilisert fosfolipider. Trinnet er etterfulgt av langsom fjerning av vaskemiddel ved en adsorbent polystyren materiale kalt Bio-perler eller Amberlite (figur 1). Den automatiske forsamlingen prosessen skjer mest sannsynlig på grunn av apolare interaksjoner mellom de hydrofobe fosfolipider, den MalFGK ₂ komplekse og overflaten på MSP amfipatiske protein. Sluttproduktet er en skiveformet partikkel laget av to molekyler av MSP innpakning rundt MalFGK ₂ kompleks. Partiklene separeres fra adduktene og aggregater ved ultra-sentrifugering og analytisk størrelse-uttrekk kromatografi. Partiklene er preget av innfødt-gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi.

title "> 1. Forberedelse av membranen scaffoldprotein, MSP

1. Den hans-merket MSP (versjon MSP1D1 ¹⁾ er produsert fra plasmid pMSP1D1 i E. coli BL21 (DE3) indusert ved OD ₆₀₀ ~ 0,5 med 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside i 3 timer ved 37 ° C.
2. Cellene blir høstet ved sentrifugering ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C og resuspendert i buffer inneholdende 100 TSG10 uM phenylmethanesulfonyl fluor.
3. Cellene lyseres med en fransk presse (3x) på 8000 psi og det uoppløselige materiale blir fjernet ved sentrifugering ved 5000 xg i 10 min ved 4 ° C. Den løselige fraksjon inneholdende MSP isoleres ved ultra-sentrifugering ved 125.000 xg i 45 minutter.
4. MSP renses ved nikkel-chelaterende kromatografi ved ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP i TSG10 buffer. Forurensninger vaskes bort med TSG10 buffer inneholdende 50 mM imidazol. MSP elueres med TSG10 buffer som inneholder 600 mmimidazole. Det rensede protein dialyseres i TSG10 buffer og lagret i -70 ° C ved en proteinkonsentrasjon på ~ 10-15 mg / ml.

2. Klargjøring av MalFGK ₂ Complex

1. The MalFGK ₂ kompleks, hans-tagget ved C-terminus av Malk, er uttrykt fra plasmid pBAD22-FGK i E. coli BL21 (DE3) og indusert ved OD ₆₀₀ ~ 0,5 med 0,2% L-arabinose i 3 timer ved 37 ° C.
2. Etter cellelyse og sentrifugering som i trinn 1.3, er membranen pelleten resuspendert i TSG20 buffer ved en sluttkonsentrasjon på 5 mg / ml. Materialet oppløseliggjøres med 1% w / v N-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) i 3 timer ved 4 ° C med forsiktig risting.
3. Det uoppløselige materialet fjernes ved ultra-sentrifugering som i trinn 1.3, og supernatanten inneholdende den oppløste MalFGK ₂ kompleks samles og renses som i trinn 1.4, men uten dialyse.
4. Further rensing oppnås ved gelfiltrering kromatografi i TSGD buffer på en Superdex 200 HR 10/300 kolonne ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min.

3. Utarbeidelse av Fosfolipider

1. En E. coli totalt lipid ekstrakt oppløst i kloroform er delt inn i 1000 nmol alikvoter i skrulokk mikrofugerør. Løsningsmidlet fordampes under en forsiktig strøm av nitrogen og tørket ytterligere over natten i et vakuum eksikator.
2. Lipidfilmen oppløses i TS-buffer ved 5 nM sluttkonsentrasjon og virvlet kraftig og sonikert. De oppløste lipider vises litt ugjennomsiktig på grunn av deres generelle uoppløselighet i vandig TS buffer, men de bør forbli i suspensjon. DDM er tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0,5% (~ 10 mm), hvor løsningen blir klar.
3. Lipid blandingen plasseres i et vannbad, og puls sonikert i 5 ganger for ~ 5 sek. Lipid Blandingen oppbevares ved 4 ° C i maksimalt 1 week.

4. Utarbeidelse av Bio-perler

1. Omtrent 10-15 ml (tørr volum) Bio-Beads plasseres i et 50 ml rør.
2. Perlene blir suksessivt vasket med 50 ml av 100% metanol, 95% etanol, milliQ H ₂ O, og endelig TS-buffer (to ganger hver).
3. De vaskede perler er lagret ved 4 ° C i ~ 10 ml TS-buffer.

5. Nanodisc Rekonstituering

1. MSP fortynnes i TSGD buffer ved den endelige konsentrasjonen av ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mm).
2. ~ 2 nmol av renset MalFGK ₂ kompleks blandes på et protein: MSP: lipid forholdet 1:3:60 eller 1:3:400 i TSGD buffer. Den endelige konsentrasjonen er 6 mikrometer ₂ MalFGK, 18 pM MSP og 360 uM lipider (1:3:60) eller 2,4 mm lipider (1:3:400). Det endelige volum er 300 ul. Den endelige DDM konsentrasjonen er 0,08% (~ 1,6 mm). Den endelige konsentrasjonen av glyserol avhenger av mengden av lipid tilsatt men forblir rundt 5-10% v / v. ~ 50 ul av Bio-Bead suspensjon tilsettes til røret, og blandingen inkubert over natten på en vuggende bord ved 4 ° C.
3. Perlene sedimenteres ved tyngdekraften og oppløsningen ble pipettert gjennom en smal spiss å unngå så mye Bio-Perler som mulig.
4. Stort bunnfall fjernes ved ultra-sentrifugering ved 100.000 xg i 20 min. Skivene er renset ved gelfiltrering kromatografi som i trinn 2.4 i TSG10 buffer. Fraksjoner inneholdende platene blir slått sammen og en delmengde skal være re-injisert på samme gelfiltreringskolonne for å teste stabiliteten av blandingen.
5. De rensede plater kan lagres ved -70 ° C i en lengre tidsperiode. Etter tining på is, bør platene utsettes for ultra-sentrifugering som i trinn 5.5 til fjerne potensielle bunnfall. En aliquot bør analyseres av gelfiltrering kromatografi for å sikre at vesentlig aggregering eller utfelling ikke oppstå under tiningprosess.

6. Native gelelektroforese

1. 1 uM av nanodiscs (~ 0,2 mg / ml) blir analysert ved innfødt SIDE ^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) for å vurdere kvaliteten av rekonstituering (figur 3A).
2. Bindingen av mannlige (1 mikrometer) til MalFGK _2-komplekset rekonstituert i nanodiscs er også vurdert av native-SIDE (figur 3A).
3. Etter elektroforese blir gelen farget med Coomassie blå i 10 min, og destained for ~ 1 time.

7. Dynamisk lysspredning (DLS)

1. Nanodiscs blir renset ved gelfiltrering kromatografi som i trinn 2.4 i TSG10 buffer ved hjelp av en Superdex 200 HR 10/300 kolonne ved en strømningshastighet på 0,1 ml / min. Fraksjoner inneholdende nanodiscs blir samlet og konsentrert til ~ 10 mg / ml med en Amicon sentrifugalfilter.
2. Prøven filtreres to ganger (0,22 um filter) før analyse av DLS hjelpen DynaPro nanostar instrument (Wyatt Technology) i en 1 pl indre volum kvarts kyvetten. Data er montert ved hjelp av DYNAMICS programvaren (Wyatt Technology) å estimere diameter og molekylvekten av partiklene.

8. ATPase Målinger

1. ATPase aktivitet av MalFGK _{2-rekonstituert} nanodiscs bestemmes ved hjelp av en kolorimetrisk analyse ^8.
2. 1 uM av rensede plater og 1 mM ATP blandes sammen med økende mengder av mannlige og inkubert ved 37 ° C i 20 min. Frigivelsen av uorganisk fosfat er målt ved 660 nm.
3. Mengden fosfat frigitt sammenlignet med en standard kurve ble generert med en Phosphorous standardløsning.

9. Representant Resultater

De nanodiscs blir renset ved gelfiltrering-kromatografi (figur 2A, til venstre). Kromatogrammet viser at majoriteten av rekonstituert discs (svart spor) eluer som en enkelt topp, mens plater laget med overflødig lipider (rød trace) eluere i tomromsvolum og som en serie av brede topper. Kvaliteten på nanodiscs er videre analysert ved innfødt gelelektroforese og dynamisk lysspredning spektroskopi (DLS). Riktig rekonstituert plater migrere som en skarp band på gelen mens de rekonstituerte i nærvær av et overskudd av lipider migrere som en smøre (Figur 2A, høyre). Analyse ved DLS viser at platen befolkningen er homogen med en gjennomsnittlig diameter på 11,4 nm (figur 2B). De rekonstituerte platene har en tilsynelatende molekylvekt på 215 kDa basert på DLS approksimasjon. Prøvene rekonstituert i nærvær av overskytende lipider skjerm vidt utbredt radier rundt 100 nm, noe som er typisk for ikke-homogene prøver.

Kvaliteten på MalFGK _2-komplekset måles ved innfødt-gelelektroforese og dens aktivitet ved ATPasemålinger (figur 3). Den maltose bindende protein MALE bindes med høy affinitet til MalFGK ₂ transportør ^{9, 10.} Anvendelse av ikke-denaturerende gelelektroforese, er det mulig å påvise en kompleks mellom mannlig og MalFGK ₂ (figur 3A). Stimulering av Malk ₂ ATPase aktivitet etter male er vist i figur 3B.

Figur 1. Typisk flytskjema for tilberedning protokollen.

Figur 2. Kvalitetskontroll av nanodisc forberedelse. A. Gelfiltrering analyse (Superdex 200 HR 10/300 kolonne) av nanodiscs rekonstituert ved lav lipidforhold (1/3/60, svart spor) eller høy lipid ratio (1/3/400, rød spor). Native gelelektroforese av den samme platen forberedelse. Molecular vekt markører i kDa er angitt. B. Dynamic lysspredning analyse av den samme platen forberedelse. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Analyse av MalFGK _2-nanodisc partikler. A. Gel shift analyse av mannlige inkubert med økende mengder av MalFGK _2-nanodisc partikler. B. ATPase aktivitet av MalFGK _2-nanodisc partikler som en funksjon av mannlig konsentrasjon.

Discussion

Vi beskriver en enkel prosedyre for rekonstituering av maltose transporter inn nanodiscs. Transportøren er ATPasen aktiv og samspillet med oppløselig bindingspartner MALE kan gjenskapes (figur 3). Den vellykkede rekonstituering av transportøren i nanodiscs åpne veien for ytterligere biofysiske og biokjemiske analyser. Av særlig interesse vil være systematisk analyse av Malk ATPase og maltose transport aktivitet i vaskemiddel, liposome og nanodiscs. ABC transportører endrer konformasjonen under transport syklusen men bidraget av lipider til disse konformasjonsforandringer endringer gjenstår å bli utforsket.

Inngåelse av nanodisc er relativt enkel, men små avvik fra optimale forhold kan føre til irreversible proteinaggregering. I denne rapporten, understreker vi viktigheten av å velge riktig protein: fett ratio fordi en overskytende beløp av lipider vil føre til production av store polydisperse liposom-lignende partikler som ikke reagerer på den biofysiske kvalifisering av en nanodisc. En tidligere analyse anvendes meget høy MSP: lipider ratio for rekonstituering av maltose transporter (1/120 mot til 1/20 i vår analyse) men partikler dannet ble ikke ytterligere karakterisert ^11. I alle fall er det viktig å nøye analysere kvaliteten av det rekonstituerte materiale ved hjelp av teknikker andre enn gelfiltrering, eksempel lysspredning spektroskopi, analytisk ultrasentrifugering eller enklere, native gelelektroforese. Betydningen av dette kvalitetskontroll ble markert under tilberedning av bacteriorhodopsin og P-glykoprotein ^12. To andre parametre kan i stor grad påvirke suksessen av rekonstituering: 1) renheten av målet membranprotein og fravær av aggregater og 2) det riktige forholdet mellom membran protein og scaffoldprotein. I tillegg, den type fosfolipid innlemmet jegnto platen, samt lengden av den membran scaffoldprotein, kan bidra til effektiviteten av rekonstitusjon. Andre parametere som løselighet og stabilitet av membranprotein i vaskemiddel, bufferen systemet, temperaturen og tiden-lengde rekonstituering kan også være nødvendig å justere ved optimalisering omdanningsprosedyren protokollen. For eksempel, membran stillaset proteiner av forskjellige lengder produserer nanodiscs av forskjellige størrelser ^1, som kan bidra til rekonstituering av større membranprotein komplekser eller membran protein oligomerer.

Den nanodisc har blitt kombinert med biofysiske metoder SPR, ITC, og fluorescens spektroskopi ^12-16 for å hjelpe membran forskning som sliter med kvantitativ metodikk. Nylig har nanodisc vært kombinert med kvantitativ massespektrometri å hjelpe å identifisere membranprotein interactomes med bedre dekning og nøyaktighet17. Den farmasøytiske industrien har vært begrenset av de samme problemene som plager akademia i å studere membran proteiner, selv om det er faktum at de mest forskrevne medisiner målet membran proteiner (reseptorer, kanaler, transportører, sensorer). Det kan forutsies at nanodisc vil hjelpe utviklingen av narkotika screening strategier som fungerer med membran innebygde proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.