En steg-för-steg metod för beredning av en ABC Transporter i Nanodisc lipidpartiklar

Summary

Nanodiscs är små skivformiga partiklar som innehåller membranproteiner i en liten lapp av fosfolipid tvåskiktsmembran. Vi tillhandahåller en visuell protokoll som visar steg-för-steg inkorporering av MalFGK2 transportören till en skiva.

Abstract

Det nanodisc är en skivformig partikel (~ 10-12 nm stor) den fällan membranproteiner i en liten bit fosfolipid tvåskiktsmembran. Den nanodisc är ett särskilt attraktivt alternativ för att studera membranproteiner, i synnerhet inom ramen av ligand-receptor-interaktioner. Metoden uppfunnen av Sligar och kollegor bygger på amfipatiska egenskaperna hos en konstruerad mycket en-spiralformad byggnadsställning protein från apolipoprotein A1. De hydrofoba ytor schavotten proteinet interagera med fettacyl sidokedjor av lipiddubbelskiktet medan polarområdena inför den vattenhaltiga omgivningen. Analyser av membranproteiner i nanodiscs har betydande fördelar jämfört med liposom eftersom partiklarna är små, homogena och vatten-lösliga. Dessutom, kan biokemiska och biofysiska metoder som normalt reserveras för lösliga proteiner appliceras, och från vardera sidan av membranet. I denna visuella protokoll, presenterar vi ett steg-för-steg rekonstitution av en väl teckenterized bakteriellt ABC-transportprotein, de manliga-MalFGK ₂ komplex. Bildandet av skivan är en självorganiserande processen som beror på hydrofoba interaktioner som äger rum under det gradvisa avlägsnandet av tvättmedlet. Vi beskriver de viktigaste stegen och vi betona vikten av att välja rätt protein-till-lipid för att begränsa bildandet av aggregat och större polydispersa liposom-liknande partiklar. Enkel kvalitetskontroller såsom gelfiltreringskromatografi, nativ gelelektrofores och dynamisk ljusspridning spektroskopi säkerställa att skivorna har blivit riktigt rekonstituerats.

Protocol

Övergripande Beredning Process

Den beredning startar genom att blanda membranet ställningen proteinet (MSP) med den renade MalFGK ₂ komplexet i närvaro av detergent-solubiliserade fosfolipider. Det steget följs av långsamma avlägsnande av detergenten genom ett adsorberande polystyrenmaterialet kallas Bio-Beads eller Amberlite (figur 1). Den automatiska monteringen sker troligen på grund av de opolära växelverkan mellan de hydrofoba fosfolipider, den MalFGK ₂ komplex och ytan av MSP amfipatiska proteinet. Den slutliga produkten är en skivformig partikel består av två molekyler av MSP inslagning runt MalFGK ₂ komplexet. Partiklarna separeras från addukterna och aggregat genom ultracentrifugering och analytisk storleksuteslutningskromatografi. Partiklarna kännetecknas av nativ-gelelektrofores och dynamisk ljusspridning spektroskopi.

titeln "> 1. Beredning av membranet Scaffold Protein, MSP

1. His-taggade MSP (version MSP1D1 ¹⁾ framställs från plasmiden pMSP1D1 i E. coli BL21 (DE3) inducerad vid OD ₆₀₀ ~ 0,5 med 0,5 mM isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid under 3 timmar vid 37 ° C.
2. Cellerna skördas genom centrifugering vid 5.000 xg i 10 min vid 4 ° C och återsuspenderades i TSG10 buffert innehållande 100 fluorid iM fenylmetansulfonyl.
3. Cellerna lyseras med en fransk press (3x) vid 8.000 psi och det olösliga materialet avlägsnas genom centrifugering vid 5.000 xg i 10 min vid 4 ° C. Den lösliga fraktionen innehållande MSP isoleras genom ultra-centrifugering vid 125.000 x g under 45 minuter.
4. MSP renas genom nickel-kelaterande kromatografi med användning ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP i TSG10 buffert. Föroreningar tvättas bort med TSG10 buffert innehållande 50 mM imidazol. MSP elueras med TSG10 buffert innehållande 600 mMimidazol. Det renade proteinet dialyseras i TSG10 buffert och lagrades i -70 ° C vid en proteinkoncentration av ~ 10-15 mg / ml.

2. Beredning av MalFGK ₂ Complex

1. Den MalFGK ₂ komplexet, His-märkt vid C-terminalen av Malk, uttrycks från plasmid pBAD22-FGK i E. coli BL21 (DE3) och inducerades vid OD ₆₀₀ ~ 0,5 med 0,2% L-arabinos under 3 timmar vid 37 ° C.
2. Efter cell-lys och centrifugering såsom i steg 1,3, är membranet pelleten återsuspenderades i TSG20 buffert vid en slutlig koncentration av 5 mg / ml. Materialet solubiliseras med 1% vikt / vol N-dodekyl-β-maltopyranosid (DDM) under 3 h vid 4 ° C med försiktig skakning.
3. Det olösliga materialet avlägsnas genom ultracentrifugering såsom i steg 1,3 och supernatanten innehållande det solubiliserade MalFGK ₂ komplexet uppsamlas och renas såsom i steg 1,4, men utan dialys.
4. FurtheR rening uppnås genom gelfiltreringskromatografi i TSGD buffert på en Superdex 200 HR 10/300 kolonn vid en flödeshastighet av 0,5 ml / min.

3. Framställning av fosfolipider

1. Ett E. E. coli total lipid extrakt upplöst i kloroform separeras i 1.000 nmol alikvoter i skruv rör cap mikrofugrör. Lösningsmedlet avdunstas under en svag ström av kväve och torkades ytterligare över natten i en vakuumexsickator.
2. Lipidfilmen löses i TS-buffert vid 5 nM slutlig koncentration och virvlades kraftigt och sonikerades. De upplösta lipider visas något ogenomskinlig på grund av deras allmänna olöslighet i vatten TS buffert, men de bör bli kvar i suspension. DDM tillsättes till en slutlig koncentration av 0,5% (~ 10 mM), vid vilken lösningen blir klar.
3. Lipidblandningen placeras i ett vattenbad och puls sonikerades under 5 gånger för ~ 5 sek. Lipidblandningen lagras vid 4 ° C under maximalt 1 pissak..

4. Beredning av Bio-Beads

1. Ca 10-15 ml (torr volym) är Bio-Beads placeras i en 50 ml tub.
2. Pärlorna tvättades successivt med 50 ml 100% metanol, 95% etanol, milliQ H ₂ O och slutligen TS-buffert (två gånger vardera).
3. De tvättade pärlorna förvaras vid 4 ° C i ~ 10 ml TS-buffert.

5. Nanodisc Rekonstituering

1. MSP späds i TSGD buffert vid den slutliga koncentrationen av ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
2. ~ 2 nmol renat MalFGK ₂ komplexet blandas vid ett protein: MSP: lipid av 1:3:60 eller 1:3:400 i TSGD buffert. Den slutliga koncentrationen är 6 M MalFGK _2, 18 M MSP och 360 lipider iM (1:3:60) eller 2,4 mm lipider (1:3:400). Den slutliga volymen är 300 | il. Den slutliga koncentrationen DDM är 0,08% (~ 1,6 mM). Den slutliga koncentrationen av glycerol beror på mängden av lipid tillsätts utan håller sig runt 5-10% v / v. ~ 50 | il av Bio-Bead suspension sättes till röret och blandningen inkuberas över natten på en gungande bord vid 4 ° C.
3. Pärlorna sedimenteras genom tyngdkraften och lösningen pipetteras genom en smal spets för att undvika så mycket Bio-Beads som möjligt.
4. Stora fällningar avlägsnas genom ultra-centrifugering vid 100.000 x g under 20 minuter. Skivorna renas genom gelfiltreringskromatografi såsom i steg 2,4 i TSG10 buffert. Fraktioner innehållande skivorna poolas och en alikvot bör återinjiceras på samma gelfiltreringskolonn för att testa stabiliteten av beredningen.
5. De renade skivorna kan lagras vid -70 ° C under en längre tid. Efter upptining på is, bör skivorna underkastas ultracentrifugering såsom i steg 5,5 för att avlägsna potentialen fällningar. En alikvot bör analyseras genom gelfiltreringskromatografi att betydande aggregering eller utfällning inte uppträder under upptiningenprocessen.

6. Nativ gelelektrofores

1. 1 pM nanodiscs (~ 0,2 mg / ml) analyseras med naturlig PAGE ^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) för att bedöma kvaliteten på rekonstitution (figur 3A).
2. Bindningen av manlig (1 M) till MalFGK _2-komplex upplöst i nanodiscs bedöms också av infödda-PAGE (Figur 3A).
3. Efter elektrofores färgades gelén med Coomassie-blått under 10 min, och avfärgades under ~ 1 timme.

7. Dynamisk ljusspridning (DLS)

1. Nanodiscs renas genom gelfiltreringskromatografi såsom i steg 2,4 i TSG10 buffert med användning av en Superdex 200 HR 10/300 kolonn vid en flödeshastighet av 0,1 ml / min. Fraktioner innehållande nanodiscs poolas och koncentreras till ~ 10 mg / ml med en Amicon centrifugalfilter.
2. Provet filtreras två gånger (0,22 pm filter) före analys genom DLS meden Dynapro nanostar instrument (Wyatt Technology) i en 1 il inre volym kvartskyvett. Data monteras med DYNAMICS mjukvara (Wyatt Technology) för att uppskatta diametern och molekylvikten av partiklarna.

8. ATPas Mätningar

1. ATPas aktiviteten hos MalFGK _{2-rekonstituerade} nanodiscs bestäms med hjälp av en kolorimetrisk analys ^8.
2. 1 pM renade skivor och 1 mM ATP blandas med ökande mängder av manliga och inkuberas vid 37 ° C i 20 minuter. Frisättningen av oorganiskt fosfat mäts vid 660 nm.
3. Mängden frisatt fosfat jämförs med en standardkurva genererad med en fosfor Standardlösning.

9. Representativa resultat

De nanodiscs renas genom gelfiltreringskromatografi (figur 2A, vänster). Kromatogrammet visar att majoriteten av den rekonstituerade discs (svart spår) eluerar som en enda topp, medan skivor gjorda med överskott lipider (röd spår) eluerar i voidvolymen och som en serie av breda toppar. Kvaliteten på nanodiscs vidare analyseras genom nativ gelelektrofores och dynamisk ljusspridning spektroskopi (DLS). Korrekt rekonstituerade skivor migrerar som ett skarpt band på gelén medan de rekonstituerade i närvaro av ett överskott av lipider migrerar som ett utstryk (figur 2A, höger). Analys genom DLS visar att skivan populationen är homogen med en medeldiameter av 11,4 nm (Figur 2B). De rekonstituerade skivorna har en skenbar molekylvikt av 215 kDa baserat på DLS tillnärmning. Prover rekonstitueras i närvaro av överskott av lipider display spridda radier runt 100 nm, vilket är typiskt för icke-homogena prover.

Kvaliteten på MalFGK ₂ komplexet bedöms av infödda gelelektrofores och sin verksamhet genom ATPasmätningar (Figur 3). Det maltosbindande proteinet MalE binder med en hög affinitet till MalFGK ₂ transportören ^{9, 10.} Använda icke-denaturerande gelelektrofores, är det möjligt att detektera ett komplex mellan MalE och MalFGK ₂ (Figur 3A). Stimulering av Malk ₂ ATPas aktivitet av manliga visas i figur 3B.

Figur 1. Typisk flödesschema för beredning protokollet.

Figur 2. Kvalitetskontroll av nanodisc preparatet. A. Gelfiltreringsanalys (Superdex 200 HR 10/300 kolonn) av nanodiscs rekonstituerades vid låg lipid (1/3/60, svart spår) eller hög lipid (1/3/400, röd spår). Nativ gelelektrofores av samma skiva beredningen. Molecular vikt markörer i kDa anges. B. Dynamisk ljusspridning analys av samma skiva beredningen. Klicka här för att se större bild .

Figur 3. Analys av MalFGK _2-nanodisc partiklar. A. Gel shift analys av manlig inkuberas med ökande mängder av MalFGK _2-nanodisc partiklar. B. ATPas aktiviteten hos MalFGK _2-nanodisc partiklar som en funktion av manlig koncentration.

Discussion

Vi beskriver ett enkelt förfarande för beredning av maltos transportören till nanodiscs. Transportören är ATPas aktiv och samspelet med den lösliga bindningspartnern MalE kan återskapas (Figur 3). Den framgångsrika rekonstituering av transportören till nanodiscs bana väg för ytterligare biofysiska och biokemiska analyser. Av särskilt intresse är den systematiska analysen Malk ATPas och maltos transportverksamhet i tvättmedel, liposom och nanodiscs. ABC transportörer byter konformationer under transporten cykeln men bidrag lipider till dessa konformationsändringar återstår att utforskas.

Skapandet av nanodisc är relativt enkelt, men små avvikelser från optimala förhållanden kan leda till irreversibel proteinaggregering. I denna rapport betonar vi vikten av att välja rätt protein: lipid eftersom ett överskott av lipider kommer att leda till production stora polydispersa liposom-liknande partiklar som inte svarar på den biofysiska kvalifikationer en nanodisc. En tidigare analys används mycket hög MSP: lipider förhållande för beredning av maltos transportör (1/120 jämfört med 1/20 i vår analys) men de bildade partiklarna inte kännetecknat ^11. I vilket fall som helst, är det viktigt att noggrant analysera kvaliteten av den rekonstituerade materialet med andra metoder än gelfiltrering, såsom ljusspridning spektroskopi, analytisk ultracentrifugering eller enklare, nativ gelelektrofores. Betydelsen av denna kvalitetskontroll belystes under beredning av bacteriorhodopsin och P-glykoprotein ^12. Två andra parametrar kan i hög grad påverka framgången av beredning: 1) renheten hos mål-membranprotein och frånvaron av aggregat och 2) det korrekta förhållandet mellan membranprotein och byggnadsställning-protein. Dessutom, typen av fosfolipid införlivat into skivan, liksom längden av membranet schavotten proteinet, kan bidra till effektiviteten av beredning. Andra parametrar såsom löslighet och stabilitet av membranprotein i detergentlösning, buffertsystemet, temperaturen och tiden längd för rekonstitution kan också behöva justeras när optimera beredning protokollet. Till exempel membranproteiner byggnadsställning proteiner av olika längder producerar nanodiscs av olika storlekar ^1, vilket kan hjälpa beredning av större komplex membranprotein eller membran oligomerer protein.

Den nanodisc har framgångsrikt kombinerat med biofysiska metoder SPR, ITC, och fluorescensspektroskopi ^12-16 för att hjälpa membran forskning som kämpar med kvantitativ metodik. Nyligen har nanodisc kombinerats med kvantitativ masspektrometri för att hjälpa att identifiera interactomes membranprotein med bättre täckning och precision17. Läkemedelsindustrin har begränsats av samma svårigheter som plågar akademin att studera membranproteiner, även om det är att de mest förskrivna läkemedel mål membranproteiner (receptorer, kanaler, transportörer, sensorer). Det kan förutsägas att nanodisc hjälper utveckling av strategier läkemedel screening som arbetar med membran inbäddade proteiner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter	Millipore	UFC805008	Follow manufacturer's protocol for proper use
Bio-Beads SM-2 Adsorbent	Bio-Rad	152-3920
E. coli total lipids	Avanti Polar Lipids	100500C	Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent
Ni sepharose HP resin	GE Healthcare	17-5268-01
Phosphorous standard solution	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
Table I. Specific reagents.
Name Composition Comments DDM stock 10% w/v DDM Resuspend in milliQ water and store at -20 °C MalFGK2 stock 1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at -70 °C after purification MSP stock 10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at -70 °C after purification in <1 ml aliquots and avoid excessive freeze/thaw cycles Phospholipid stock 5 nM E. coli total lipids 0.5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C for 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7.9 50 mM NaCl Store at 4 °C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol Store at 4 °C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glycerol Store at 4 °C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v/v glycerol 0.03% w/v DDM Store at 4 °C and add DDM just before use Table II. Solution recipes.