Summary
Décrit ici est une technique dans laquelle lipopolysaccharide est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon pour simuler la mammite, une condition souvent causée par une infection bactérienne. Des résultats d'injection de lipopolysaccharide à l'augmentation du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, visualisé par l'imagerie de bioluminescence d'une souris NF-kB rapporteur de la luciférase.
Abstract
Les modèles animaux de maladies humaines sont nécessaires afin d'étudier rigoureusement les étapes de progression de la maladie et des mécanismes connexes, et finalement, comme modèles pré-cliniques pour tester les interventions. Dans ces méthodes, nous décrivons une technique dans laquelle le lipopolysaccharide (LPS) est injecté dans la glande mammaire en lactation de la souris via le mamelon, mastite modélisation efficace, ou l'inflammation, de la glande. Il en résulte une augmentation des infections simulées du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) de signalisation, tels que révélés par l'imagerie de bioluminescence d'une souris NF-kB rapporteur de la luciférase 1.
Notre but ultime dans le développement de ces méthodes était d'étudier l'inflammation associée à la mammite dans la glande en lactation, qui comprend souvent des rougeurs, de l'enflure et l'infiltration de cellules immunitaires 2,3. Par conséquent, nous étions tout à fait conscients que l'incision ou tout autre type de blessure de la peau, le mamelon, ou de la glande afin d'introduire les LPS pourraitpas être utilisés dans nos méthodes comme l'approche serait probablement confondre la lecture de l'inflammation. Nous avons également souhaité une méthode straight-forward qui ne nécessitent pas spécialement conçus dessinés à la main pipettes ou l'utilisation de micro-manipulateurs d'organiser ces outils spécialisés en place. Ainsi, nous avons décidé d'utiliser une seringue à insuline disponible dans le commerce et d'injecter l'agent dans le conduit mammaire d'un mamelon intacte. Cette méthode a été un succès et nous a permis d'étudier l'inflammation associée à l'injection de LPS, sans effets supplémentaires recouvertes par le processus d'injection. En outre, cette méthode a également utilisé un NF-kB luciférase reporter souris transgénique et la technologie d'imagerie bioluminescente pour montrer visuellement et quantitativement augmenté de signalisation NF-kB dans la glande LPS-injecté 4.
Ces méthodes sont d'intérêt pour les chercheurs de nombreuses disciplines qui souhaitent modèle de maladie dans la glande mammaire en lactation, en fin de compte, la techniquedécrit ici pourrait être utilisée pour l'injection d'un certain nombre de substances, et ne se limite pas au LPS seulement.
Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvés par les soins des animaux Vanderbilt University institutionnel et Use Committee.
1. Préparation des souris transgéniques
- Chez les souris femelles, positifs pour le journaliste NGL (N F-KB-G FP-L uciferase) transgène (décrit précédemment 1) sont utilisés pour cette procédure. Lorsque les femmes sont au moins 6 semaines d'âge, les accoupler avec un mâle de type sauvage FVB. Harem reproduction peut être utilisé (jusqu'à 4 femelles dans une cage avec 1 mâle). (S'il vous plaît noter: des souris de souche FVB ont été utilisés pour l'étude des souris de souche comme les plus sombres C57BL6 peuvent aussi être utilisés, mais ces souris doit être rasée avant l'imagerie.).
- À partir de 15 jours après l'accouplement, les femelles vérifier régulièrement les signes de la grossesse (grande circonférence en saillie). Chaque femelle doivent être séparés une fois enceinte et le mâle retiré de la cage d'élevage une fois que la dernière femelle devient enceinte.
- Regardez les femelles séparés d'uned notez la date de naissance lors d'une litière apparaît. Une portée de 6 chiots au moins est nécessaire pour la lactation adéquate. Huit jours après la naissance de la litière, procéder avec le protocole (voir la figure 1 pour un schéma chronologique).
2. Préparation pour injection
- Dissoudre le E. LPS coli dans du PBS à une concentration finale de 0,1 ug / ul. 50 ul de cette solution, soit un total de 5 ug, sera injecté dans la glande mammaire. Préparer un second tube de PBS seul à être utilisé pour le contrôle d'injection.
- Mise en place d'un microscope à dissection et de l'équipement anesthésie à l'isoflurane. Un appareil ogive doit être fixé au stade de la portée de dissection où la souris sera placé. Une bonne source de lumière, qu'il s'agisse du champ d'application lui-même ou de projecteurs supplémentaires devraient également être préparés.
- Une fois que l'installation est terminée, démarrez la machine isoflurane et le débit d'air.
3. Injection intra-canalaire de LPS
- Chargez la seringue à aiguille courte avec 50 ul de la solution de LPS. Mettre cela de côté.
- Anesthésier la souris pour être injecté en plaçant d'abord la femelle dans une boîte remplie isoflurane et puis une fois que la respiration est ralentie, la déplacer sur la scène et placez son nez dans le ogive. Utilisez un pincement de l'orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Surveiller la respiration de la souris tout au long de la procédure et ajuster le niveau de l'isoflurane en conséquence. La cage contenant la portée de chiots que la femelle a été prise à partir devraient être soigneusement mis de côté jusqu'à ce que le barrage peut être retourné après la procédure.
- Utilisez une petite goutte d'éthanol à 70% pour rendre la couche à plat et pour aider à visualiser le mamelon attachée au droit n ° 4 glande mammaire inguinale sur le bas-ventre de la souris.
- Faites la mise au microscope à dissection pour une vue optimale sur le mamelon. Soigneusement utiliser un ensemble de pinces fines pour mieux tirer sur le mamelon de la peau, mais ne pas percer ou de blesser le mamelon en aucune façon. Lapince ne doit jamais être étroitement serrées ensemble lors de la manipulation des tissus, mais utilisé avec une tenue légère qui exige le minimum de stress sur le mamelon.
- Utilisez la pince à la main gauche pour tenir doucement le mamelon en place. Ramenez lentement la seringue préremplie dans le champ de vision avec la main droite. La seringue doit être maintenu de façon qu'aucun repositionnement doit se produire afin d'injecter du contenu.
- Lorsque la seringue est en vue, viser soigneusement à la petite ouverture canalaire dans le centre du mamelon, et insérez la seringue.
- Sans repositionner la main, injecter le contenu de la seringue et retirer l'aiguille de la tétine.
- Chargez une seconde seringue avec 50 ul de PBS pour l'injection de commande. Repositionner la souris sur la scène et de la meilleure vue de la gauche N ° 4 mamelon glande mammaire inguinale de l'autre côté du bas-ventre de la souris. Répétez les étapes 3,4 à 3,7 à l'aide de la seringue PBS-chargé.
- Une fois que les injections sont complEté, cesser l'anesthésie et déplacez la souris dans une cage de récupération. Surveiller la femelle afin d'assurer qu'elle devient mobile dans les 5 min. Laissez la souris pour rester dans la cage de récupération pendant 1 heure. Après 1 heure de récupération, placez le dos femelle dans la cage avec sa portée de chiots. Les souris doivent être surveillés régulièrement pendant 6 heures après l'injection avant de procéder à l'imagerie. Dans notre expérience, pas de conséquences indésirables ont été observés dans les deux la femelle ou les chiots pendant la période entre l'injection et l'imagerie. Cependant, si les signes de détresse sont observées chez la femelle (par exemple une posture voûtée, mordre ou de gardiennage du site d'injection, léthargie générale) ou les petits (pas de mouvement, la couleur bleutée de la peau), l'expérience devrait être abandonnée.
4. Bioluminescent d'imagerie pour visualiser l'activité de NF-kB
- Une fois que les souris ont été transportés à l'établissement d'imagerie, commencer la procédure d'imagerie en ouvrant le logiciel et l'initialisation de la machine. Allumez l'estMachine oflurane et du débit d'air, en sorte que l'anesthésie est fluide à la fois le boîtier et la chambre d'imagerie.
- Placez la souris sous anesthésie à l'isoflurane dans la zone de l'anesthésie clair. Une fois que la respiration s'est ralentie, utilisez un pincement de l'orteil pour confirmer la souris est totalement anesthésié. Puis, injecter 100 ml de substrat luciférine dans la souris par injection rétro-orbitale 5 à l'aide d'une seringue stérile.
- Transférer immédiatement la souris vers la chambre d'imagerie et de placer son nez sous l'isoflurane ogive qui s'y trouvent. La souris doit être en position couchée. Fixez chaque pied de la scène avec du ruban adhésif.
- Entrée des paramètres appropriés pour le logiciel IVIS de prendre à la fois une image de lumière blanche et d'une image photographique de l'activité bioluminescente. Le temps d'exposition doit être de 10 sec. Acquérir l'image.
- Une fois que les images ont été acquises, permettent de récupérer la souris, puis placez le dos dans la cage avec ses chiots et de surveiller périodiquement.
- La photographie et luminescentles images sont automatiquement superposées et affichées sur l'écran, comme dans la figure 2. Analyser les images acquises par la mise région d'intérêt ROI "ou" cercles de taille égale sur chaque côté du bas de l'abdomen de la souris (une au-dessus de la glande PBS-injectée et une sur la glande LPS-injecté). Réglez la lecture à des photons. Un certain nombre devrait s'afficher, indiquant la luminescence détectée à l'intérieur de chaque ROI (voir la figure 2B). Utilisez ce numéro dans l'analyse statistique.
- Pour afficher une image optimale, ajuster encore le seuil du signal affiché. Cela ne modifie pas la luminescence totale de lecture, mais vous permettra de retirer signal de fond et de visualiser les différences entre le contrôle et la LPS-traitée glande. Diminuer la quantité de luminescence montre jusqu'à ce que la glande PBS-injecté est exempt de bruit de fond. Cela devrait laisser le signal accrue dans la glande LPS-traitée encore visible dans l'image, comme le montre la figure 2.
- Additionaanalyse l, y compris les protéines et les analyses de l'ARN, peut être complété par des tissus mammaires de la femelle recueillies post-mortem 6.
5. Les résultats représentatifs
Pour obtenir des résultats interprétables par ces méthodes, le LPS (ou PBS) doit être perfusé uniquement dans les canaux galactophores, laissant intacts les tissus adjacents. L'injection dans le tissu sous-cutané entourant le mamelon se traduira par une inflammation due à une blessure plutôt que l'infection simulée. L'injection de colorant bleu trypan dilué dans du PBS est utile lors de l'apprentissage de la technique. Figure 3A montre une glande injecté avec succès infusé avec 100 pi de bleu trypan dans du PBS. Comme le montre, seul l'arbre canalaire doit être rempli avec la solution injectée, et il ne devrait pas être bolus au site d'injection. Un «bolus» dans ce contexte est une accumulation de liquide injecté au niveau du mamelon ou dans le tissu qui entoure le mamelon sans perfusion dans l'arbre canalaire. C'est shpropres à la figure 3B. S'il vous plaît noter que les injections pratique montre la figure 3 ont été achevés en une femme au jour 21 de la lactation. Au plus fort de la lactation (jour 8-10, le stade auquel le LPS est injecté à l'aide du protocole actuel), le lait est abondant et il est difficile de visualiser les conduits et déterminer si l'injection a été effectuée correctement. Par conséquent, les points plus tard, le temps de l'allaitement sont meilleurs pour la pratique des injections.
Injection réussie de LPS dans les résultats des conduits mammaires chez augmenté l'activité de NF-kB dans la glande. Cela devrait être évident chez la souris journaliste sur IVIS imagerie, et la glande LPS-injecté devrait avoir sensiblement plus forte activité luciférase (mesurée par comptage de photons) que la glande PBS-injecté, comme le montre la figure 2 (en moyenne, la glande LPS lit 200% du signal de commande PBS). Une augmentation statistiquement significative de la luminescence dans les glandes LPS traités comme un échantillonARED au contrôle controlatérale a été réalisé si la fin d'un groupe de 4 souris 4. Une autre étude a également utilisé l'injection intra-canalaire mammaire soit E. coli ou de LPS dans le NF-kB journaliste transgéniques. Semblable à notre propre travail, ces auteurs ont constaté une augmentation significative de l'activité du rapporteur 6 heures après E. coli injection 2.
S'il vous plaît noter qu'en raison constitutive de NF-kB activité dans le cerveau et d'autres organes de l'abdomen, la tête et l'abdomen de souris nos reporters montrent régulièrement un signal lorsque imagé, même au départ, avant toute manipulation. Ainsi, ce signal doit être ignoré en ce qui concerne cette expérience. Un signal clair doit rester dans la glande mammaire LPS-injectée après la lecture d'image est ajustée pour réduire la luminescence d'arrière-plan dans la glande PBS. Figure 2 montre des images avec le fond réduit.
Échec de l'injection de la glande seraplus probable résultat d'endommager le mamelon. Cela entraînera fait, la peau au niveau de l'inflammation qui sera évident sur l'imagerie. Ce type de signal blessure sera très forte et confinée à la région du mamelon où le dommage est survenu, n'émanant pas toute la glande, comme on le voit, après une injection de LPS succès dans les conduits.
Figure 1. Schéma de procédure.
Figure 2. Les résultats représentatifs de l'imagerie IVIS bioluminescente. (A) Acquisition de l'image avec un fond réduit, révélant augmentation de l'activité luciférase dans la glande LPS-injecté. (B) l'image de A avec la région de quantifications d'intérêt ajouté. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3 d'injection de pratique:.. Glande mammaire injection de colorant par injection intracanalaire Pour tester la précision de l'administration par l'intermédiaire du mamelon, une souris au jour 21 de la lactation a été injecté avec 100 ul de colorant bleu trypan dilué dans du PBS. Après le sacrifice, la glande a été exposé pour la visualisation. (A) d'injection de succès et (B) un bolus de colorant à la tétine.
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Discussion
Ici, nous utilisons une souris transgénique journaliste NF-kB et une technique d'injection optimisé à la mammite modèle, une inflammation du tissu mammaire le plus souvent causée par une infection bactérienne. L'étape la plus critique dans cette procédure est l'injection intracanalaire lui-même.
Dans la pratique, il est généralement difficile de déterminer si l'injection intracanalaire a été couronnée de succès. L'injection des agents (LPS ou PBS) devrait se sentir fluide et il devrait y avoir peu ou pas de résistance lorsque la seringue est vide. Le piège le plus commun est d'endommager le raccord menant au passage obstrué dans la glande. Cela peut être visualisée en regardant le mamelon à travers le microscope à dissection. Les dommages peuvent être évités par une pratique suffisante, de délicatesse lors de la manipulation du mamelon, et en veillant à ce que seul le plus petit des aiguilles (31G ou supérieur) est utilisé pour effectuer la procédure. En outre, si l'aiguille n'est pas correctement positionné, ou si elle glisse mi-injection, une constructionCréations de LPS ou du PBS peut former au niveau du site d'injection et le liquide ne puisse pas envahir les conduits. Si cela se produit, vous pouvez soit visuellement l'accumulation de liquide dans la peau autour du mamelon, ou l'injection ne se sentent pas fluide. Bien que cet écueil ne peut pas être totalement éliminé, les événements peuvent être évités en grande partie par la pratique et par l'utilisation des outils appropriés.
La technique utilisée ici pour l'injection était critique pour cette expérience particulière. Certaines méthodes publiées pour l'injection intracanalaire dans la glande mammaire nécessitent de coupe / retrait du mamelon et / ou de l'incision à travers la peau 7,8. Dans ce cas, le critère d'évaluation primaire de l'étude était de déterminer NF-kB inflammation associée au sein de la glande, des incisions ou des perturbations de la peau ou du mamelon sont indésirables et induirait un signal inflammatoire due à la lésion tissulaire qui confondrait le signal induit par le LPS.
En outre, notreinjection a été réalisée avec une seringue à insuline disponibles dans le commerce et sans l'utilisation d'une micro-pipette ou tiré micromanipulateurs, comme dans plusieurs autres méthodes pour l'injection qui n'utilisent pas le retrait mamelon 9, 10. Nous croyons que ce fut possible que parce que le mamelon qui allaitent est légèrement agrandie et un peu plus facile d'injecter à une jeune vierge mamelon de la souris. Pour injecter des souris vierges, des outils plus rigoureuses peuvent être nécessaires.
Il ressort clairement de la figure 2 que si elle est correctement réalisée, l'injection de LPS dans les conduits de la glande mammaire de la souris provoque une inflammation localisée comme visualisé par une augmentation de l'activité de NF-kB rapporteur de la luciférase. D'autres ont analysé plus en détail ce modèle de mammite aiguë, soit par E. coli ou d'injection de LPS dans la glande mammaire et l'analyse subséquente des tissus 2-3, 8, 10-14. Parmi les nombreuses conclusions, ces études montrent que la réponse inflammatoire is modulé par des interactions avec CD14, et qu'il en résulte un afflux de polynucléaires neutrophiles régulée par les macrophages alvéolaires mammaires. Comme le suggère la fois notre travail déjà publié 4, ainsi que celle des autres 2 ce modèle de mammite peuvent ensuite être utilisées pour étudier les mécanismes et thérapeutiques pertinentes chez l'homme, où le plus grand nombre de 3 à 33% des femmes qui allaitent souffrent de cette infection douloureuse (pourcentage pouvant varier selon la méthodologie de l'étude) 15. Il peut également s'avérer un outil de recherche utile pour ceux dans l'industrie laitière, où la mammite est une maladie coûteuse qui entraîne des pertes importantes dans la production de lait chaque année 16.
Enfin, les souris transgéniques utilisées LGN reporter ici et les souris fonctionne de la même journaliste HLL 17 ont été utilisés dans de nombreuses études afin de vérifier, quantifier et suivre la réglementation haut ou le bas de l'activité de NF-kB dans une variété de maladies et de modèles de développement, y compris aiguë poumoncancer du poumon blessures, les voies aériennes morphogenèse de ramification, résistance à l'insuline, l'obésité et l'infarctus du myocarde 1, 17-21. Ce modèle fournit un exemple supplémentaire de l'utilité de ces produits transgéniques rapporteurs.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le NIH subvention accordée à CA113734 F Yull et le ministère des Affaires des anciens combattants (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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