הזרקת Intraductal של LPS כמודל עכבר של דלקת בשד: איתות מדמיינת דרך NF-κB כתב מהונדס
Summary
מתואר כאן היא טכניקה שבה lipopolysaccharide מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק באמצעות עכבר הפטמה כדי לדמות דלקת בשד, מצב שנגרם בדרך כלל על ידי זיהום חיידקים. תוצאות הזרקה בLipopolysaccharide מוגברת גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, מדמיינים באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB.
Abstract
מודלים בבעלי חיים למחלות אנושיות הם הכרחיים על מנת ללמוד בקפדנות שלבי התקדמות מחלה ומנגנונים נלווים, וסופו של דבר, כמודלים טרום קליניים כדי לבדוק התערבויות. בשיטות אלה, אנו מתארים טכניקה שבה lipopolysaccharide (LPS) מוזרקת לתוך בלוטת החלב המניק עכבר דרך הפטמה, ביעילות הדלקת בשד דוגמנות, או דלקת, של הבלוטה. תוצאות זיהום זה מדומה במוגבר גרעינית גורם kappa B (NF-κB) איתות, ראו בעיני רווחו באמצעות הדמית bioluminescent של עכבר כתב לוציפראז NF-κB 1.
המטרה שלנו בפיתוח שיטות אלה הייתה ללמוד הדלקת קשורה בדלקת בשד בבלוטת המניקות, אשר לעתים קרובות כוללת אדמומיות, נפיחות, וחדירה לתא חיסונית 2,3. לכן, היינו מודעים היטב לכך שחתך, או כל סוג של פציעה של העור, הפטמה, או בלוטה כדי להציג את יכל LPSלא להיות מנוצל בשיטות שלנו מאז שהגישה הזאת עשויה לבלבל את הקריאה מתוך של דלקת. אנחנו גם רצויים שיטה ישר קדימה, שלא הצריך pipettes נעשה במיוחד מצויר ביד או על השימוש בmicromanipulators להחזיק כלים מיוחדים האלה במקום. לפיכך, אנו נחושים להשתמש במזרק אינסולין זמין מסחרי ולהזריק לתוך סוכן צינור החלב של פטמה ללא פגע. שיטה זו הייתה מוצלחת ואפשרה לנו ללמוד הדלקת קשורה בהזרקת LPS ללא תופעות נוספות מעולפות על ידי התהליך של הזרקה. בנוסף, שיטה זו מנוצלת גם NF-κB לוציפראז כתב מהונדס עכבר וטכנולוגיית הדמית bioluminescent חזותי וכמותית להראות גדל NF-κB איתות בתוך הבלוטה LPS-4 המוזרקת.
שיטות אלה הן עניין לחוקרים מתחומים רבים המבקשים למחלת מודל בתוך בלוטת חלב מניקות, כסופו של דבר, הטכניקהמתואר כאן יכול להיות מנוצל עבור זריקה של מספר החומרים, ואינו מוגבל לLPS בלבד.
Protocol
Discussion
כאן אנו מנצלים עכבר מהונדס NF-κB כתב וטכניקת הזרקה מותאמת לדלקת בשד מודל, דלקת ברקמת השד נגרמת לרוב על ידי זיהום חיידקים. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא הזרקת intraductal עצמו.
בפועל, זה בדרך כלל ברור אם הזרקת intraductal הייתה מוצלחת. ההזרקה ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH CA113734 הוענק לF Yull והמחלקה לענייני יוצאי הצבא (TS לקוול).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
References
- Everhart, M. B., Han, W., Sherrill, T. P., Arutiunov, M., Polosukhin, V. V., Burke, J. R., Sadikot, R. T., Christman, J. W., Yull, F. E., Blackwell, T. S. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury. The Journal of Immunology. 176, 4995-5005 (2006).
- Notebaert, S., Carlsen, H., Janssen, D., Vandenabeele, P., Blomhoff, R., Meyer, E. In vivo imaging of NF-κB activity during Escherichia coli-induced mammary gland infection. Cellular Microbiology. 10, 1249-1258 (2008).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Neutrophil recruitment in endotoxin-induced murine mastitis is strictly dependent on mammary alveolar macrophages. Veterinary Research. 41, 10 (2010).
- Connelly, L., Barham, W., Pigg, R., Sait-Jean, L., Sherrill, T., Cheng, D. S., Chodosh, L. A., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Activation of nuclear factor kappaB in mammary epithelium promotes milk loss during mammary development and infection. J. Cell. Physiol. 222, 73-81 (2010).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40, 155-160 (2011).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. (21), e2828 (2011).
- Behbod, F., Kittrell, F. S., LaMarca, H., Edwards, D., Kerbawy, S., Heestand, J. C., Young, E., Mukhopadhyay, P., Yeh, H., Allred, D. C., Hu, M., Polyak, K., Rosen, J. M., Medina, D. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Research. 11, R66 (2009).
- Zheng, J., Watson, A. D., Kerr, D. E. Genome-wide expression analysis of lipopolysaccharide-induced mastitis in a mouse model. Infection and Immunity. 74, 1907-1915 (2006).
- Nguyen, D., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. . Intraductal Injection into the Mouse Mammary Gland. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , 259-270 (2000).
- Lee, J. W., Paape, M. J., Zhao, X. Recombinant bovine soluble CD14 reduces severity of experimental Escherichia coli mastitis in mice. Veterinary Research. 34, 307-316 (2003).
- Elazar, S., Gonen, E., Livneh-Kol, A., Rosenshine, I., Shpigel, N. Y. Essential role of neutrophils but not mammary alveolar macrophages in a murine model of acute Escherichia coli mastitis. Veterinary Research. 41, 53 (2010).
- Bannerman, D. D., Paape, M. J., Hare, W. R., Sohn, E. J. Increased levels of LPS-binding protein in bovine blood and milk following bacterial lipopolysaccharide challenge. Journal of Dairy Science. 86, 3128-3137 (2003).
- Gonen, E., Vallon-Eberhard, A., Elazar, S., Harmelin, A., Brenner, O., Rosenshine, I., Jung, S., Shpigel, N. Y. Toll-like receptor 4 is needed to restrict the invasion of Escherichia coli P4 into mammary gland epithelial cells in a murine model of acute mastitis. Cellular Microbiology. 9, 2826-2838 (2007).
- Notebaert, S., Demon, D., Vanden Berghe, ., Vandenabeele, T., P, ., Meyer, E. Inflammatory mediators in Escherichia coli-induced mastitis in mice. Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases. 31, 551-565 (2008).
- Osterman, K. L., Rahm, V. A. Lactation mastitis: bacterial cultivation of breast milk symptoms, treatment, and outcome. Journal of Human Lactation. 16, 297-302 (2000).
- Sordillo, L. M., Streicher, K. L. Mammary Gland Immunity and Mastitis Susceptibility. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 7, 135-146 (2002).
- Blackwell, T. S., Yull, F. E., Chen, C. L., Venkatakrishnan, A., Blackwell, T. R., Hicks, D. J., Lancaster, L. H., Christman, J. W., Kerr, L. D. Use of genetically altered mice to investigate the role of nuclear factor-kappa B activation and cytokine gene expression in sepsis-induced ARDS. Chest. 116, 73S-74S (1999).
- Stathopoulos, G. T., Sherrill, T. P., Cheng, D. S., Scoggins, R. M., Han, W., Polosukhin, V. V., Connelly, L., Yull, F. E., Fingleton, B., Blackwell, T. S. Epithelial NF-kappaB activation promotes urethane-induced lung carcinogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 18514-18519 (2007).
- Blackwell, T. S., Hipps, A. N., Yamamoto, Y., Han, W., Barham, W. J., Ostrowski, M. C., Yull, F. E., Prince, L. P. NF-κB signaling in fetal lung macrophages disrupts airway morphogenesis. The Journal of Immunology. 187, 2740-2747 (2011).
- Chiang, S. H., Bazuine, M., Lumeng, C. N., Geletka, L. M., Mowers, J., White, N. M., Ma, J. T., Zhou, J., Qi, N., Westscott, D. The protein kinase IKKepsilon regulates energy balance in obese mice. Cell. 138, 961-975 (2009).
- Singh, M. V., Kapoun, A., Higgins, L., Kutschke, W., Thurman, J. M., Zhang, R., Singh, M., Yang, J., Guan, X., Lowe, J. S. Ca2+/calmodulin-dependent kinase II triggers cell membrane injury by inducing complement factor B gene expression in the mouse heart. The Journal of Clinical Investigation. 119, 986-996 (2009).
