Summary
ここで説明する乳腺炎をシミュレートするために、ニップルを介して、授乳中のマウス乳腺に注入されるリポ多糖体で技術は、一般的に細菌感染によって引き起こされる症状である。増加した核因子κB（NF-κB）シグナル伝達におけるリポ多糖注射の結果は、NF-κBルシフェラーゼレポーターマウスの生物発光イメージングを通して可視化した。
Abstract
前臨床モデルでは介入をテストするようなヒト疾患の動物モデルは、究極的には厳密に病気の進行と関連機構のステージを勉強するために必要である、と。これらの方法では、リポ多糖が（LPS）は腺の乳頭、効果的にモデリング乳腺炎、または炎症を介して授乳マウス乳腺に注入する手法を説明します。増加核因子κB（NF-κB）シグナル伝達において、このシミュレートされた感染症の結果は、NF-κBルシフェラーゼレポーターマウス1の生物発光イメージングを通して可視化した。
これらの方法を開発する上で私たちの究極の目標は、しばしば赤みを含む乳腺における乳腺炎、腫れ、免疫細胞浸潤2,3に関連する炎症を勉強することでした。そこで我々は、LPSを切開または皮膚損傷の任意のタイプ、ニップル、またはグランドを導入するために、と痛感でしたでしたアプローチは、おそらく炎症の読み出しを混同するから我々の方法で利用することはありません。我々はまた、特別に作られた手描きのピペットまたは代わりにこれらの特殊なツールを保持するために、マイクロマニピュレーターを使用する必要はありませんでしたストレートフォワード方式を希望する。従って、我々は市販のインスリン注射器を使用するとそのまま乳首の乳管に薬剤を注入することを決定した。この方法は成功したと私たちは注射のプロセスによってオーバーレイの追加効果なしLPS注射に関連する炎症を勉強することができました。さらに、この方法はまた、視覚的かつ定量的NF-κB活性は、LPSを注射した腺4内シグナル伝達の増加表示し、NF-κBルシフェラーゼレポータートランスジェニックマウスおよび生物発光イメージング技術を利用した。
これらの方法は、最終的に、授乳中の乳腺内の疾患をモデル化したい多くの分野の研究者が関心を持つ技術であるここで説明する多くの物質を注入するために利用することができ、LPSのみに限定されない。
Protocol
全ての動物実験は、バンダービルト大学機関動物実験委員会によって承認された。
1。トランスジェニックマウスを準備
- NGL（N F-κBG FP-L uciferase）レポーター遺伝子（以前に1に記載）陽性雌マウスは、この手順のために使用されます。女性は年齢の少なくとも6週間である場合、FVB野生型の雄でそれらを交配。繁殖は（1男性とケージ内の最大4匹）に使用されるかもしれませんハーレム。 （ご注意：FVB株マウスは現在の研究のために使用されたようなC57BL6と暗く系統マウスを用いてもよいが、これらのマウスは、前イメージングに剃らなければなりません。）
- 15日後に交配から始まり、妊娠の兆候（大突出胴回り）を定期的にメスを確認してください。それぞれの女性は一度妊娠区切らなければなりませんし、最後の女性が妊娠したらオスは繁殖ケージから取り外す。
- 分離された女性を見守るDごみが表示される誕生日をメモしておきます。少なくとも6仔のごみは、適切な授乳のために必要です。ごみの誕生8日後には、プロトコル（タイムラインの概略図は図1を参照）に進みます。
2。注射用製剤
- 大腸菌を溶解0.1μg/μLのの最終濃度にPBS中大腸菌 LPS。この溶液に、または5μgの合計50μlを、乳腺に注入される。制御インジェクションに使用するPBS単独の第二の管を準備します。
- 解剖の範囲及びイソフルラン麻酔機器をセットアップします。ノーズコーン装置は、マウスが置かれる解剖スコープのステージに固定する必要があります。良い光源は、スコープ自体から、または余分なスポットライトからかどうかも準備する必要があります。
- セットアップが完了すると、イソフルランマシンと空気の流れを開始する。
3。 LPSの管内注射
- LPS溶液50μlと短い針の注射器をロードします。さておき、これを設定してください。
- 呼吸が遅くれた後に、マウスが最初にイソフルラン埋めボックスに女性を配置することによって、注入する麻酔と、ステージ上に彼女を移動させ、ノーズコーン内に彼女の鼻を配置します。マウスは完全に麻酔であることを確認するつま先のピンチを使用しています。手順全体を通してマウスの呼吸を監視し、それに応じてイソフルランレベルを調整します。ダムは手続き後に返されるようになるまで女性をから取られていることを子犬のくずを含むケージは慎重に取っておくべきである。
- コートは平らにすると、マウスの下腹部の上で右第4鼠径乳腺に添付ニップルを視覚化するために70％エタノールの小滴を使用しています。
- ニップルの最適なビューのための解剖スコープを当てる。慎重にさらに皮膚から離れて乳首を引き出すために細かい鉗子のセットを使用しますが、どのような方法でニップルを穴をあけたり、けがをしないでください。ザ鉗子はしっかり組織を操作するときに一緒にクランプされていませんが、乳首へのストレスを最小量を必要とする光ホールドと一緒に使用すべきではない。
- 穏やかな場所に乳首を保持するために左手に鉗子を使用しています。徐々に右手を使用して、ビューのフィールドにプリロード注射器を持って来る。シリンジがないポジショニングが内容を注入するために発生することがありませんように保持されるべきである。
- シリンジがビューに追加されると、乳首の中心内小腺管開口部を慎重に目指し、注射器を挿入します。
- 手の位置を変えずに、注射器の内容物を注入し、乳首から針を外します。
- 対照注射用をPBS50μlの2番目の注射器をロードします。ステージ上で、マウスの下腹部の反対側の左第4鼠径部乳腺乳頭の最高の眺めのためのマウスの位置を変更します。 PBS-充填した注射器を使って手順3.4から3.7を繰り返します。
- 両方の注射はCOMPLになったら、ETE麻酔を中止し、回復ケージにマウスを移動します。彼女は5分以内に携帯になることを保証するために女性を監視します。マウスは1時間回復ケージのままにします。回復の1時間後、仔の彼女のごみとケージに雌の背面に配置します。マウスは、定期的に画像に進む前に、6時間後に注射を監視する必要があります。我々の経験では、有害な結果は、注射とイメージングの間の期間に女性または子犬のいずれかで認められなかった。苦痛の兆候が（かむや注射部位、一般的な無気力の警護、 例えば猫背の姿勢）または仔（動かない、皮膚の青みがかった色）の雌で認められた場合しかし、実験は中止すべきである。
4。 NF-κBの活性を可視化するための生物発光イメージング
- 一度マウスを画像化施設に輸送されており、ソフトウェアを起動し、マシンを初期化することにより、撮影手順を開始します。でオンにしますofluraneマシンと空気の流れ、麻酔ボックスとイメージング室の両方に流れていることを確実にする。
- 明確な麻酔ボックスにイソフルラン麻酔下でマウスを置きます。呼吸が鈍化していると、マウスが完全に麻酔であることを確認するつま先のピンチを使用しています。その後、無菌の注射器を用いて眼窩注射5でマウスにルシフェリン基質100μlを注入します。
- 直ちにイメージング室にマウスを移すと、そこにあるイソフルランノーズコーンの下で彼女の鼻を配置します。マウスは仰臥位でなければならない。テープでステージにそれぞれの足を固定します。
- IVISソフトウェアへの入力が適切な設定を白色光写真画像と生物活動のイメージの両方を取る。露光時間は10秒である必要があります。画像を取得する。
- 一度画像が取得された、マウスが回復することを可能にしてから、彼女の子犬とケージに彼女の背中を配置し、定期的に監視します。
- 写真および発光画像を自動的に重ね合わせて図2のように、画面に表示されます。マウスの下腹部の両側（PBS注入腺上の1とLPS注入腺上の1）の上に関心領域または等しいサイズの "ROI"の円を配置することによって取得された画像を分析します。光子に読み出し設定します。数（ 図2Bを参照）、各ROI内で検出された発光を示すメッセージが表示されるべきである。統計分析で、この番号を使用します。
- 最適な画像を表示するには、さらに表示された信号のしきい値を調整します。これは、総発光を読み取るアウト改変することはありませんが、あなたがバックグラウンド信号を除去し、制御およびLPS処理腺の違いを視覚化することができます。 PBSを注入腺がバックグラウンド信号から外れるまでに示す発光量を減らします。これは、 図2に示すように画像でまだ見かけLPS処理腺における増加した信号を残す必要があります。
- Additionaタンパク質およびRNAアッセイを含むリットル分析は、6事後女性から採取した乳腺組織で完了することができる。
5。代表的な結果
これらのメソッドから解釈可能な結果を得るために、LPSは（またはPBS）隣接組織はそのままにしておいて、唯一の乳管に注入しなければなりません。乳首を囲む皮下組織に注射ではなくシミュレー感染より傷害に起因する炎症になります。技術を学習するときにPBSで希釈し、トリパンブルー色素の注入に便利です。 図3Aは、PBS中でトリパンブルー液100μlを注入に成功注入腺を示しています。示されているように、唯一の管木が注入された溶液で満たされるべきであり、注射部位全くボーラスがあってはならない。この文脈での "ボーラス"は乳首で乳管またはツリーに注入することなく、乳首の周りの組織で注入された液体の蓄積である。これはshです図3Bの独自の。 図3に示すように練習注射は授乳21日目に女性に完成しましたのでご了承ください。授乳の高さ（一日8月10日、LPSは現在のプロトコルを使用して注入された段階）の間に、牛乳は豊富であり、それはダクトを視覚化し、注射が正しく完了したかどうかを判断することは困難である。そのため、授乳の後の時間のポイント、練習注入に優れています。
内乳管の結果へのLPSの成功注入は腺内のNF-κBの活性を増加させた。これは、IVISイメージング時のレポーターマウスで明らかにする必要があり、LPSを注入腺は（平均して、 図2に示すように、PBSを注射した腺よりも実質的に高いルシフェラーゼ活性を（光子計数により測定）を有するべきであると、LPS腺を読み取りPBSの制御信号の200％）。 compとしてLPS処理腺内の発光の統計的に有意な増加反対側の制御にaredは4匹の4群の完成にもかかわらず達成された。つの追加の研究は 、Eのいずれかの管内乳腺注射を利用しているNF-κBレポーター遺伝子組み換えに大腸菌またはLPS。私たち自身の仕事と同様に、これらの著者は、6時間後に、E.レポーター活性の有意な増加が見られました大腸菌注入2。
撮像されたときに脳や他の腹部臓器内での恒常的NF-κB活性のために、注意してください、私たちのレポーターマウスの頭部と腹部は一貫して前の任意の操作にさえ、ベースライン時、信号を示しています。したがって、この信号は、この実験に関して無視されるべきである。明らかな信号は、画像の読み出しをPBS腺でバックグラウンド発光を最小限に抑えるように調整された後、LPS注入乳腺内にとどまるべきである。 図2は、バックグラウンドが低減した画像を示しています。
腺の失敗の注入は意志乳首への損傷が起こる可能性が最も高い。これは、撮像時は明らかであろう指摘し、皮膚レベルの炎症の原因となります。負傷信号のこのタイプは、ダクトに成功したLPS注射後に見られるように、腺を通して発散しない、非常に強く、被害が発生した乳頭部に限定されます。
図1。手順の概略。
図2。 IVIS生物発光イメージングからの代表的な結果。（）バックグラウンドで画像を取得したがLPSを注射した腺の増加ルシフェラーゼ活性を明らかに減少させた。 （B）からのイメージ関心数量化の領域が追加された。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3練習注入：。乳腺は乳管内注射を介して色素を注入したニップルを介した配信の精度をテストするには、授乳21日目のマウスは、PBSで希釈したトリパンブルー色素の100μlを注入した。犠牲に続いて、腺は可視化のために露出した。 （A）が成功した噴射と乳首の色素（B）のボーラス。
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Discussion
ここでは、トランスジェニック、NF-κBレポーターマウスとモデル乳腺炎に最適化された注入技術を利用し、乳房組織の炎症は、最も一般的に細菌感染によって引き起こされる。この手順の中で最も重要なステップは、管内注射そのものです。
実際には、膵管内注入が成功したかどうか通常は明らかである。薬剤の注入（LPSまたはPBS）は、流体に感じるはずと注射器が空になると抵抗なしにはほとんどあるはずです。最も一般的な落とし穴は腺に閉塞通路につながる乳頭へのダメージです。これは解剖スコープを通して乳首を見ることで、可視化することができる。ダメージは十分な練習、珍味乳首を操作し、針（31G以上）の唯一の最小の手順を実行するのに使用されていることを確認することですることで回避できます。さらに、それは半ば注射、ビルド·スリップした場合、針の位置が正しくない場合、またはLPSまたはPBSのアップは、注射部位に形成することができ、液体は、ダクトに浸透しません。この問題が発生した場合は、どちらか視覚的に乳首の周りの皮膚内の液体の蓄積を見たり、注射は、流体を感じることはありません。この落とし穴は完全に排除することはできませんが、出現は練習によって、適切なツールを使用することにより、ほとんどの部分は避けることができます。
注射のためにここで使用される技術は、この特定の実験のために重要であった。乳腺に膵管内注入のためのいくつか公開されている方法は、皮膚を通して7,8ニップルおよび/ または切開の切断/除去を必要とする。試験の主要エンドポイントは、腺内のNF-κB関連する炎症を決定することであったように、このケースでは、皮膚またはニップルのいずれかの切開又は摂動は望ましくたと混同するであろう組織の損傷に起因する炎症シグナルを誘導するLPS誘発信号。
さらに、当社の注射はニップルの除去（9）（10）を利用しない注射のためのいくつかの他の方法のように、市販のインスリン注射器で、描画マイクロピペットまたはマイクロマニピュレーターを使用せずに完了しました。授乳中の乳首がわずかに拡大し、若い、処女マウス乳頭より注入することがやや容易であるため、我々は、これが唯一の実行可能だったと思います。処女マウスを注入するために、より厳密なツールが必要になることがあります。
それが正しく実行された場合、マウス乳腺のダクトへのLPSの注入は、NF-κBルシフェラーゼレポーター活性の増加により可視化など、ローカライズされた炎症を引き起こすことが図2からも明らかである。その他は、 大腸菌のいずれかを介して、急性乳腺炎のこのモデルをより広範囲に分析してきた乳腺組織と2-3、8、10月14日のその後の分析に大腸菌やLPS注射。多くの調査結果の中で、これらの研究は、炎症反応iのことを示しているのCD14との相互作用によって変調され、それはそれは、乳腺胞マクロファージによって規制好中球流入をもたらす。として母乳育児、女性の多くは3から33％が、この痛みを伴う感染症に苦しむ私たちの以前に発行されたワーク4と同様に、他人のことを乳腺炎の2このモデルはさらに、ヒトでの関連のメカニズムと治療法を研究するために使用してもよいし、両方で提案されている15（割合は、研究の方法論に基づいて異なります）。乳腺炎は、毎年16牛乳生産の大幅な損失につながるコストのかかる疾患である場所でも、酪農産業のそれらのための有用な研究ツールを証明するかもしれない。
最後に、ここで使用NGLジェニックレポーターマウスと同様に機能HLLレポーターマウス17は 、検証定量化し、急性などの病気や発達の多様なモデルの中でのNF-κB活性のアップまたはダウンレギュレーションを追跡するために、多くの研究で用いられてきた肺けが、肺がん、気道分岐形態形成、インスリン抵抗性、肥満、心筋梗塞1、17から21。このモデルでは、これらのレポータートランスジェニックのユーティリティの追加の例を示しています。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、F共に葬り去ると退役軍人局（TSブラックウェル）に授与NIHの助成金CA113734によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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