Summary
A continuación se describe una técnica en la que lipopolisacárido se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón mediante la boquilla para simular la mastitis, una condición comúnmente causada por una infección bacteriana. Resultados lipopolisacárido de inyección en el aumento del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, visualizado a través de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero luciferasa NF-kB.
Abstract
Los modelos animales de enfermedad humana son necesarios con el fin de estudiar rigurosamente las etapas de progresión de la enfermedad y los mecanismos asociados, y en última instancia, como modelos pre-clínicos para probar intervenciones. En estos métodos, se describe una técnica en la que el lipopolisacárido (LPS) se inyecta en la glándula mamaria lactante ratón a través del pezón, mastitis efectivamente modelado, o la inflamación, de la glándula. Esto resulta en un aumento de infección simulada del factor nuclear kappa B (NF-kB) de señalización, como se visualiza a través de formación de imágenes bioluminiscentes de un ratón reportero NF-kB de luciferasa 1.
Nuestro último objetivo en el desarrollo de estos métodos fue estudiar la inflamación asociada con la mastitis en la glándula lactantes, que a menudo incluye enrojecimiento, hinchazón, y la infiltración de células inmunes 2,3. Por lo tanto, hemos sido muy conscientes de que la incisión o cualquier tipo de heridas de la piel, el pezón o la glándula con el fin de introducir los LPS podríano ser utilizada en nuestros métodos desde el enfoque probablemente confundir la lectura de salida de la inflamación. También se desea un método straight-forward que no requería especialmente hechos a mano de pipetas o el uso de micromanipuladores para sostener estas herramientas especializadas en su lugar. Por lo tanto, se determinó que usar una jeringa de insulina comercialmente disponible y para inyectar el agente en el conducto mamario de un pezón intacto. Este método fue exitoso y nos permitió estudiar la inflamación asociada con la inyección de LPS, sin efectos adicionales superpuestos por el proceso de inyección. Además, este método también se utiliza un NF-kappa B luciferasa de ratones transgénicos y la tecnología bioluminiscente de imágenes para mostrar visualmente y cuantitativamente aumentado NF-kB de señalización dentro de la glándula inyectadas con LPS 4.
Estos métodos son de interés para los investigadores de muchas disciplinas que deseen modelo de enfermedad en la glándula mamaria, en última instancia, la técnicadescrito aquí podría ser utilizado para la inyección de un número de sustancias, y no se limita a LPS solamente.
Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el Cuidado de Animales institucional la Universidad de Vanderbilt y el empleo.
1. Preparación de ratones transgénicos
- Los ratones hembra, positivos para el transgén reportero NGL (N F-kappa B-G FP-L uciferase) (descrito anteriormente 1) se utilizan para este procedimiento. Cuando las hembras son por lo menos de 6 semanas de edad, los aparearse con un macho de tipo salvaje FVB. Harem reproducción pueden ser utilizados (hasta 4 hembras en una jaula con 1 macho). (Nota: ratones FVB cepa se utilizaron para el estudio actual más oscuros tales como ratones de la cepa C57BL6 también se pueden usar, pero estos ratones debe ser afeitado antes de la imagen.).
- Comenzando a los 15 días post-apareamiento, las hembras comprobar regularmente para detectar signos de embarazo (circunferencia grande que sobresale). Cada mujer debe separarse una vez embarazada y el hombre retirado de la jaula de cría una vez que la última mujer queda embarazada.
- Mira las hembras separadas unad anotar la fecha de nacimiento cuando una camada aparece. Una camada de al menos 6 cachorros se requiere para una lactancia adecuada. Ocho días después del nacimiento de la camada, proceder con el protocolo (ver Figura 1 para un esquema de línea de tiempo).
2. Preparación para inyección
- Disolver la E. coli LPS en PBS a una concentración final de 0,1 mg / l. 50 l de esta solución, o un total de 5 g, se inyecta en la glándula mamaria. Preparar un segundo tubo de PBS solo para ser utilizado para la inyección control.
- Establecer un microscopio de disección y aparatos de anestesia con isoflurano. Un aparato de nariz de cono debe ser asegurado a la etapa del alcance de disección en la que se coloca el ratón. Una buena fuente de luz, ya sea desde el propio ámbito o de focos adicionales también deben estar preparados.
- Una vez que la configuración se ha completado, en marcha la máquina isoflurano y flujo de aire.
3. Inyección intraductal de LPS
- Cargue la jeringa con aguja corta con 50 l de la solución de LPS. Establezca este lado.
- Se anestesia el ratón para inyectar colocando primero la hembra en una caja llena de isoflurano y luego una vez la respiración se hace más lenta, trasladarla al escenario y colocar la nariz dentro de la nariz de cono. Utilice una pizca dedo para confirmar que el ratón es completamente anestesiado. Controlar la respiración del ratón durante todo el procedimiento y ajustar el nivel de isoflurano en consecuencia. La caja que contiene la camada de cachorros que la hembra ha sido tomado de debe ser cuidadosamente a un lado hasta que la presa puede ser devuelto después del procedimiento.
- Utilice una pequeña gota de etanol al 70% para hacer la capa en posición plana y para ayudar a visualizar el pezón unido a la derecha # 4 de glándula mamaria inguinal en el abdomen inferior del ratón.
- Enfocar el microscopio de disección para una visión óptima del pezón. Cuidadosamente utilizar un conjunto de pinzas finas para extraer aún más el pezón de la piel, pero no perfore ni lesionar el pezón de ninguna manera. Lafórceps nunca deben estar bien sujetos entre sí cuando la manipulación del tejido, sino que se utiliza con una bodega luz que requiere la mínima cantidad de tensión en el pezón.
- Utilice las pinzas en la mano izquierda para sostener suavemente el pezón en su lugar. Poco a poco llevar la jeringa precargada en el campo visual usando la mano derecha. La jeringa debe mantener de manera que no tiene que ocurrir reposicionamiento con el fin de inyectar el contenido.
- Una vez que la jeringa está a la vista, apuntar con cuidado a la pequeña abertura ductal en el centro de la boquilla, e insertar la jeringa.
- Sin tener que reposicionar la mano, inyectar el contenido de la jeringa y retirar la aguja de la boquilla.
- Cargar una segunda jeringa con 50 l de PBS para el control de la inyección. Vuelva a colocar el ratón sobre el escenario y la mejor vista de la izquierda # 4 pezón inguinal glándula mamaria en el otro lado de la parte baja del abdomen del ratón. Repita los pasos 3,4 a 3,7 utilizando la jeringa cargada con PBS.
- Una vez que ambas inyecciones son complete, deje de anestesia y mover el ratón en una jaula de recuperación. Monitorear la hembra para asegurar que se hace móvil dentro de 5 min. Permitir el ratón para permanecer en la jaula de recuperación de 1 hr. Después de 1 hora de recuperación, coloque la hembra en la jaula con su camada de cachorros. Los ratones deben controlarse periódicamente durante 6 horas después de la inyección antes de proceder a la creación de imágenes. En nuestra experiencia, sin consecuencias adversas se observaron tanto en la hembra o las crías durante el período entre la inyección y formación de imágenes. Sin embargo, si se presentan signos de angustia se observan en las mujeres (por ejemplo, postura encorvada, morder o vigilancia de la zona de inyección, letargo general) o las crías (sin movimiento, color azulado de la piel), el experimento debe ser interrumpido.
4. Bioluminiscente de imágenes para Visualice la actividad NF-kB
- Una vez que los ratones han sido transportados a la facilidad de formación de imágenes, comenzar el procedimiento de formación de imágenes por abrir el software y la inicialización de la máquina. Encienda el esoflurane máquina y de flujo de aire, asegurando que la anestesia está fluyendo a través del cuadro y la cámara de formación de imágenes.
- Coloque el ratón bajo anestesia isoflurano en el cuadro de anestesia claro. Una vez que la respiración se ha desacelerado, utilice una pizca dedo para confirmar que el ratón es completamente anestesiado. A continuación, se inyectan 100 l de sustrato de luciferina en el ratón por retro-orbital de inyección 5 utilizando una jeringa estéril.
- Transferir inmediatamente el ratón a la imagen de la cámara y coloque la nariz bajo el isoflurano nariz de cono se encuentra allí. El ratón debe estar en decúbito supino. Asegure cada pie a los escenarios con una cinta.
- De entrada de los ajustes adecuados en el software IVIS a tomar tanto una imagen en blanco luz fotográfica y una imagen de la actividad bioluminiscente. El tiempo de exposición debe ser de 10 seg. Adquirir la imagen.
- Una vez que las imágenes han sido adquiridas, permitir el ratón para recuperarse y luego colocar la espalda en la jaula con sus cachorros y supervisar periódicamente.
- La fotografía y luminiscentelas imágenes se superpone automáticamente y se visualiza en la pantalla, como en la Figura 2. Analizar las imágenes adquiridas mediante la colocación de la región de interés o "ROI" círculos de igual tamaño sobre cada lado de la parte inferior del abdomen del ratón (una sobre la glándula PBS-inyectado y una sobre la glándula inyectó LPS). Ajuste la lectura a los fotones. Un número se debe mostrar indicando la luminiscencia detectada dentro de cada ROI (ver Figura 2B). Utilice este número en el análisis estadístico.
- Para mostrar la imagen óptima, además ajustar el umbral de la señal mostrada. Esto no va a alterar la luminosidad total de lectura, pero le permitirá eliminar la señal de fondo y visualizar las diferencias entre el control y la glándula tratado con LPS. Disminuir la cantidad de luminiscencia se muestra, hasta la glándula PBS-inyectado está libre de la señal de fondo. Esto debería dejar el aumento de la señal en la glándula tratado con LPS todavía aparente en la imagen, como se ve en la Figura 2.
- Se dispone del análisis, incluyendo proteínas y los ensayos de ARN, se puede completar con tejido mamario obtenida de la mujer post-mortem 6.
5. Los resultados representativos
Para obtener resultados interpretables de estos métodos, LPS (o PBS) debe ser infundida sólo en los conductos mamarios, dejando el tejido adyacente intacto. La inyección en el tejido subcutáneo que rodea el pezón dará lugar a inflamación debido a una lesión en lugar de la infección simulada. La inyección de colorante azul de tripano diluido en PBS es útil cuando el aprendizaje de la técnica. Figura 3A muestra una glándula con éxito inyecta infundido con 100 l de azul de tripano en PBS. Como se muestra, sólo el árbol ductal debe ser llenado con la solución inyectada, y no debería haber ningún bolo en el sitio de inyección. Un "bolo" en este contexto es una acumulación del líquido inyectado en el pezón o en el tejido que rodea el pezón sin infusión en el árbol ductal. Esto es SHpropio en la Figura 3B. Tenga en cuenta que las inyecciones de prácticas que se muestran en la Figura 3 se completaron en una hembra en el día 21 de lactancia. Durante la altura de la lactancia (días 8-10, la etapa en la que se inyecta LPS utilizando el protocolo de corriente), la leche es abundante y es difícil de visualizar los conductos y determinar si la inyección se ha completado correctamente. Por lo tanto, los puntos de tiempo después de la lactancia son mejores para las inyecciones de práctica.
El éxito de la inyección de LPS en los resultados de los conductos mamarios en mayor actividad NF-kB dentro de la glándula. Esto debería ser evidente en el ratón reportero sobre IVIS formación de imágenes, y la glándula LPS-inyectado debe tener una actividad sustancialmente mayor de luciferasa (medida por conteo de fotones) que la glándula PBS inyectado, tal como se muestra en la Figura 2 (en promedio, la glándula LPS lee 200% de la señal de control de PBS). Un aumento estadísticamente significativo en la luminiscencia dentro de las glándulas tratadas con LPS como borradorared al control contralateral se logra a través de la finalización de un grupo de 4 ratones 4. Un estudio adicional se ha utilizado también la inyección intraductal de mama de cualquiera de E. coli o LPS a NF-kB reportero transgénicos. Al igual que en nuestro propio trabajo, estos autores observaron un aumento significativo en la actividad de reportero 6 horas después de que E. coli inyección 2.
Tenga en cuenta que debido a la constitutiva NF-kB actividad en el cerebro y otros órganos abdominales, los jefes y abdomen de ratones nuestro reportero muestran consistentemente una señal cuando fotografiado, incluso al inicio del estudio antes de cualquier manipulación. Por lo tanto, esta señal debe ser ignorado con respecto a este experimento. Una señal obvia debe permanecer dentro de la glándula mamaria inyectó LPS después de la lectura de imagen de salida se ajusta para minimizar la luminiscencia de fondo en la glándula PBS. Figura 2 muestra imágenes con el fondo reducido.
Inyección incorrecta de la glándula semás probable resultado daños en el pezón. Esto hará que señaló, la piel a nivel de la inflamación que será evidente en formación de imágenes. Este tipo de señal de herida será muy fuerte y se limita a la zona del pezón, donde se produjo el daño, al no proceder en toda la glándula, como se ve después de una exitosa inyección de LPS en los conductos.
Figura 1. Esquema de Procedimiento.
Figura 2. Los resultados representativos de IVIS bioluminiscente de imágenes. (A) Adquirida imagen con fondo reducido, revelando aumento de la actividad de la luciferasa en la glándula inyectadas con LPS. (B) Imagen de una región con cuantificaciones de interés añadido. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3 Práctica de inyección:.. Glándula mamaria inyectado con tinte a través de inyección intraductal Para comprobar la precisión de la entrega a través del pezón, un ratón en el día 21 de lactancia fue inyectado con 100 l de colorante azul de tripano diluido en PBS. Tras el sacrificio, la glándula se expuso para la visualización. (A) inyección exitosa y (B) en bolo de medio de contraste en el pezón.
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Discussion
Aquí utilizamos un transgénico NF-kB ratón periodista y una técnica de inyección optimizado para mastitis modelo, la inflamación del tejido mamario más comúnmente causada por una infección bacteriana. El paso más crítico en este procedimiento es la inyección intraductal sí mismo.
En la práctica, por lo general es evidente si la inyección intraductal ha tenido éxito. La inyección de los agentes (LPS o PBS) debe sentirse fluido y no debería haber poca o ninguna resistencia como la jeringa se vacía. La trampa más común es la lesión del pezón que conduce al paso obstruido en la glándula. Esto puede ser visualizado por palabras en el pezón a través del microscopio de disección. El daño puede ser evitado por la práctica suficiente, delicadeza al manipular el pezón, y asegurándose de que sólo la más pequeña de las agujas (31G o superior) se utiliza para realizar el procedimiento. Además, si la aguja no está colocado correctamente, o si se desliza a mediados de inyección, una compilación-Up de LPS o PBS se puede formar en el sitio de inyección y el líquido no se impregnan los conductos. Si esto sucede, usted puede ver visualmente la acumulación de líquido en la piel alrededor del pezón, o la inyección no se sentirá fluido. Aunque esta trampa no puede ser eliminado totalmente, las ocurrencias se pueden evitar en su mayor parte por la práctica y mediante el uso de las herramientas adecuadas.
La técnica utilizada aquí para inyección era crítico para este experimento particular. Algunos métodos publicados para inyección intraductal en la glándula mamaria requieren de corte / remoción de la boquilla y / o la incisión a través de la piel 7,8. En este caso, como el punto final primario del estudio fue determinar NF-kB inflamación relacionada dentro de la glándula, las incisiones o la perturbación de la piel o del pezón eran indeseables y podría inducir una señal inflamatoria debido a la lesión del tejido que se frustran la señal inducida por LPS.
Además, nuestroinyección se completó con una jeringa de insulina comercialmente disponible y sin el uso de una micropipeta o dibujado micromanipuladores, como en varias otras metodologías para la inyección que no utilizan eliminación pezón 9, 10. Creemos que sólo se pudo realizar porque el pezón en período de lactancia es ligeramente ampliada y algo más fácil de inyectar a un pezón joven, ratón virgen. Para inyectar ratones vírgenes, las herramientas más rigurosas pueden ser requeridos.
Es claro por la figura 2 que, si se realiza correctamente, la inyección de LPS en los conductos de la glándula mamaria de ratón provoca inflamación localizada como se visualiza mediante un aumento de la actividad de NF-kB reportero de la luciferasa. Otros han analizado más extensamente este modelo de mastitis aguda, ya sea a través E. coli o inyección de LPS en la glándula mamaria y el análisis subsiguiente del tejido 2-3, 8, 10-14. Entre muchos hallazgos, estos estudios ilustran que la respuesta inflamatoria is modulada por la interacción con CD14, y que da lugar a un influjo de neutrófilos regulada por los macrófagos alveolares mamarias. Como se sugiere en tanto nuestro trabajo previamente publicado 4, así como la de otros 2 este modelo de la mastitis puede usarse además para estudiar los mecanismos y agentes terapéuticos relevantes en humanos, donde hasta un 3-33% de las mujeres que amamantan sufren de esta infección dolorosa (porcentaje varía en función de la metodología del estudio) 15. También puede ser una herramienta útil de investigación para aquellos en la industria láctea, donde mastitis es una enfermedad costosa que conduce a pérdidas significativas en la producción de leche al año 16.
Finalmente, los ratones transgénicos reportero LGN utilizados aquí y los ratones funcionamiento similar HLL reportero 17 se han utilizado en numerosos estudios para verificar, cuantificar, y el seguimiento de la regulación hacia arriba o hacia abajo de NF-kB actividad dentro de una variedad de modelos de enfermedad y de desarrollo incluyendo aguda pulmónlesión, cáncer de pulmón, la morfogénesis vías respiratorias ramificación, resistencia a la insulina, la obesidad, el infarto de miocardio y 1, 17-21. Este modelo proporciona un ejemplo adicional de la utilidad de estos transgénicos reportero.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por el NIH subvención CA113734 adjudicado a F Yull y el Departamento de Asuntos de Veteranos (TS Blackwell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli (LPS) |
Sigma | L 2880 | serotype 055:B5 |
| PBS | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| 31 Gauge insulin syringe | Becton Dickinson | 328438 | Short needle |
| Forceps | World Precision Instruments | 15908 | |
| Dissecting scope | Leica | M3Z | |
| Terrell Isoflurane, USP | MINRAD INC. for Rx Elite | NDC 66794-011-25 | |
| IVIS 200 imaging system | Caliper (formerly Xenogen) | N/A | |
| Syringe for luciferin injection | Becton Dickinson | 309597 | 1cc; 26G5/8 |
| D-Luciferin Firefly, sodium salt monohydrate (Luciferin substrate) |
Biosynth Chemistry and Biology | L-8240 | Dilute to 10 mg/ml |
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