Summary
Systematiskt, storskaliga syntetiska genetiska (gen-gen eller epistasis) interaktion skärmar kan användas för att utforska genetiska redundans och väg överhörning. Här beskriver vi en hög genomströmning kvantitativ syntetisk genteknik array screening kallas eSGA som vi utvecklat för att belysa epistatisk relationer och utforska genetiska interaktion nätverk
Abstract
Fenotyper bestäms av en komplex serie av fysiska (t.ex. protein-protein) och funktionell (t.ex. gen-gen eller genetisk) interaktioner (GI) 1. Även fysiska interaktioner kan ange vilka bakteriella proteiner associerade som komplex, de inte nödvändigtvis avslöjar väg-nivå funktionella relationships1. GI skärmar, där tillväxten av dubbla mutanter som bär två borttagna eller inaktiverade gener mäts och jämförs med motsvarande enkla mutanterna, kan belysa epistatisk beroenden mellan loci och därmed ge möjlighet att söka och upptäcka nya funktionella relationer 2. Storskaliga GI kartor har rapporterats för eukaryota organismer som jäst 3-7, men GI information förblir gles för prokaryoter 8, vilket hindrar den funktionella notering av bakteriella genom. För detta ändamål har vi och andra utvecklade hög kapacitet kvantitativa bakteriella GI screeningmetoder 9, 10
Här presenterar vi de viktigaste stegen som krävs för att utföra kvantitativa E. E. coli Syntetisk Genetisk Array (eSGA) screeningsförfarande på arvsmassan skala 9, med naturliga bakteriella konjugering och homolog rekombination till systemiskt generera och mäta kondition stort antal dubbla mutanter i en koloni arrayformat. Kortfattat en robot används för att överföra genom konjugering, kloramfenikol (cm) - märkta mutantalleler från konstruerad HFR (Hög frekvens av rekombination) givare stammar "i en ordnad uppsättning av kanamycin (Kan) - märkta F-mottagare stammar. Vanligtvis använder vi förlust av funktion enstaka mutanter bär icke väsentliga gen deletioner (t.ex. "Keio-kollektion 11) och väsentliga gen hypomorphic mutationer (dvs. alleler som ger minskad proteinuttryck, stabilitet eller aktivitet 9, 12, 13) till fråga de funktionella sammanslutningar av icke-essentiella och essentiella gener, respectively. Efter konjugering och därpå följande genetiskt utbyte medierad genom homolog rekombination, är de resulterande dubbla mutanterna selekterades på fast medium innehållande båda antibiotika. Efter utväxt, plattorna digitalt avbildas och koloni storlekar kvantitativt värderade med hjälp av ett eget automatiserat system bildbehandling 14. GIS är avslöjas när tillväxten av en dubbel mutant är antingen mycket bättre eller sämre än förväntat 9. Försvårande (eller negativ) GIS resulterar ofta mellan förlust av funktion mutationer i par gener från kompensatoriska vägar som inkräktar på samma grundläggande processen 2. Här, är förlusten av en enda gen buffrad, så att antingen enda mutant är livskraftig. Dock är förlusten av både vägar skadlig och leder till syntetisk dödlighet eller sjukdom (t.ex. långsam tillväxt). Omvänt, kan lindra (eller positiv) interaktioner sker mellan gener i samma väg eller proteinkomplex 2 somradering av antingen gen sig ofta tillräckligt för att störa den normala funktionen av vägen eller komplexa så att ytterligare störningar inte minskar aktiviteten, och därmed tillväxten, ytterligare. Sammantaget kan systematiskt identifiera och analysera GI nätverk ger objektiva globala kartor över de funktionella sambanden mellan ett stort antal gener, som väg-information på missas av andra metoder kan härledas 9.
Protocol
1. Konstruera HFR Cavalli Donor mutantstammar genom Recombineering 15, 16
Stegen för att konstruera eSGA givare fläckar beskrivs nedan. Kortfattat använder vi riktade λ - Röd förmedlas homolog rekombination 16 av förstärkt valbar DNA-markör kassett fragment genereras av PCR för att skapa icke-väsentliga mutanter gendeletion (avsnitt 1,1) eller essentiell gen hypomorphic mutantstammar donator (avsnitt 1,2), som sedan används som "frågor" för att definiera GI nätverk.
Obs: Under den tekniska utvecklingsprocessen, bedömde vi effektiviteten av att använda HFR-medierad konjugativ överföring för att kombinera mutationer med en väldefinierad Hfr donator stam (HFR Cavalli, Hfr Hayes och Hfr 3000). Vi undersökte (i) förmåga att effektivt göra givare mutanter med den recombineering metod uppfunnen av Yu et al. (2000) 16, (ii) de relativa effektivitetenav konjugativ DNA överföring av olika kromosomala markörer, och (iii) effekterna av frågan gen position och kromosomal orientering relativt HFR överföringen lokus, oriT. Vi fann att λ - Röd-medierad homolog rekombination effektivitet var mycket högre i Hfr Cavalli än i Hfr Hayes eller Hfr3000. Om så krävs, kan P1 transduktion eller en pseudo Hfr-stam 17, användas för att skapa mutanta givare. Vi har framgångsrikt anpassat dessa metoder för att göra och screena ett stort antal givare. Eftersom våra experiment rättegång konjugation, observerade den totala effektiviteten för överföring och antalet fd conjugants var signifikant större med Hfr Cavalli, var denna stam bakgrund valts för givare konstruktion och storskalig eSGA. Alla förfaranden för eSGA skärmar med HFR Cavalli givare beskrivs.
- Amplifiering av DNA-fragment för efterföljande recombineering att radera en icke-essentiell gen
Anställa två steg innesluten PCR förstärkarefiering (figur 1) för att skapa en kassett gendeletion för att ersätta målet öppna läsramen med en CM resistensmarkör från pKD3 plasmiden (GI: 15.554.330, protein ID: AAL02033.1) 15. Markören är flankerad av FRT-ställen 11 tillåter avlägsnande av resistensgenen, om nödvändigt, i uppföljning experiment.
Obs: Vi kapslade två steg PCR för att avlägsna plasmiden från den förstärkta produkt som används sedan för att transformera bakteriecellerna. Ta bort plasmiden (i den första PCR) och sedan skapa kassetten genen knockout i den andra PCR är nödvändigt eftersom transformation med en plasmid är mycket effektivare än recombineering, och målet är att få - så mycket som möjligt - endast stammar som har framgångsrikt ersatt den målinriktade genomiskt DNA med den selekterbara markören. Ett alternativ till kapslad PCR är att utföra en restriktionsklyvning av plasmiden utanför regionen amplifieras i den andra PCRsteg. Då produkten av restriktionsspjälkning renas och används som en mall i den kapslade PCR-steget (1.1.2). Detta alternativ är också enkelt, men kräver mer arbete upp tid.- Användning ca 45 ng pKD3 som ett templat i PCR med framåt F1 och bakåt R1 primrar att producera en 1.070 bp produkt. Rena PCR-fragmentet med användning av Qiagen PCR-reningskit protokoll och späd produkten i sterilt destillerat vatten till 5 ng / pl koncentration.
- Använda renade PCR-produkten som en mall, inrätta en andra PCR med genspecifika (t.ex. knockout) kapslade primrar, F2 och R2, som har (i) 45 nt av genspecifika homologa regioner vid 5'-ändarna för att tillåta för homolog rekombination omedelbart uppströms och nedströms av målgenen att ersätta den med Cm resistensmarkören och (ii) 20 nt vid 3'-ändarna för att prima syntesen av Cm markör. Storleken av den producerade fragmentet är 1.123 bp. De genspecifika homologi regionerna är utformade för att ta bort målet opsv läsram medan en angränsande eller delvis överlappande kodande segment intakta. Efter denna förstärkning vidare till steg 1,3.
- Förstärka en märkning kassett för att skapa en nödvändig gen hypomorphic mutation
- För att konstruera hypomorphic givare mutantstammar, lägga till en C-terminal sekventiell peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofta något påverkar grundläggande protein funktion genom destabiliserande utskrift överflöd (dvs. protein antalet exemplar) eller proteinveckning / aktivitet. För detta ändamål skapa en valbar SPA-tagg (SPA-Cm) DNA-mall genom att omvandla Kan resistensmarkören i pJL148 18 till Cm med hjälp recombineering mellan identiska nukleotidsekvenser som flankerar Kan markör i pJL148 och Cm markör i pKD3 15. Den resulterande mallen består av i-ram-SPA-tagg följt av en Cm resistensmarkör, och är lämplig för PCR-amplifiering, recombineering och efterföljande eSGA 12.
Notera: </ Strong> Essential gener är potentiellt mest intressanta för studier genfunktion. Eftersom dessa gener kan inte raderas, hade innovativa metoder utvecklas för att undersöka de funktionella relationer viktiga gener. Flera lämpliga mycket framgångsrika metoder har utvecklats först i jäst. Exempelvis Davierwala et al. (2005) 19 utförda GI skärmar med en panel av 575 temperaturkänsliga essentiell gen mutanter och fann att viktiga gener uppvisade ungefär fem gånger så många geografiska beteckningar som onödiga gener. Likaså Breslow et al. (2008) 20 utvecklat en "minskad överflöd av mRNA-störning" (DAMP) metod att generera ett bibliotek av hypomorphic alleler som täcker ~ 82% av essentiella jästgener att studera vägar och komplex. Den fuktiga tillvägagångssättet ändrar 3'-änden av den uttryckta mRNA minska nivån av målgenen 6, sannolikt på grund av mRNA destabilisering. I likhet med den fuktiga tillvägagångssättet 6, vår Strategy har varit att utnyttja de subtila effekterna av att störa 3-änden av den uttryckta mRNA viktiga proteiner.
När vi beskriver nedan, inte taggen i sig sannolikt inte påverkar proteinveckning eller funktion, men den subtila störning av mRNA genom taggen är tillräcklig, när den kombineras med miljöfaktorer eller andra mutationer, för att avslöja funktionellt informativa gen-miljö 13 och gen -gen 9, 12 interaktioner.
Först hittills, vi använde SPA-taggar för att rena ~ 3.000 essentiella och icke-essentiella E. coli proteiner 21-23, med över 80% av de 307 E. coli viktiga proteiner som representerade bland våra SPA-märkta stammar 8. Eftersom taggen framgångsrikt använts för att isolera kända proteinkomplex, som är ömsesidigt bekräftades (dvs. samma komplex kan isoleras genom märkning och rening olika proteiner från samma komplex) och de isolerade komplexen var biologiskt relevant, vi anledningen till att taggarna göravanligtvis inte påverkar proteinveckning eller funktion 12. Likaså visade våra opublicerade observationer att taggen i sig inte brukar påverkar stam tillväxt. Men motiverade vi att ändra 3'-UTR genom att integrera taggen och markören kassetten som rapporterades för fuktiga stammarna 6, kan destabilisera vissa transkript på RNA-nivå eller, i sällsynta fall, hindra korrekt veckning eller funktion fusionsproteiner. Därför förutspådde vi att kombinera sådana störda alleler av essentiella gener med andra funktionellt relevanta mutationer på andra ställen i genomet skulle resultera i informativt geografiska beteckningar, som verkligen observerades 9, 12. Dessutom SPA-märkta alleler av essentiella gener uppvisade gen-miljö interaktioner (t.ex. läkemedel överkänslighet) enligt fenotypiska profilering arbete av Nichols et al. (2011) 13, som utsätts en delmängd av SPA-märkta viktiga stammar till olika odlingsbetingelser. Samma studie confirmed att de flesta (54 av 58 testade) SPA-märkta viktiga stammar uppvisade nedsatt kondition i en eller flera odlingsbetingelser 13, som stöder uppfattningen att SPA-taggen skapar ofta milda hypomorphic alleler i viktiga gener som är användbara för genomet hela GI skärmen applikationer inklusive eSGA. - Amplifiera märkning kassetten från SPA-Cm mall med genspecifika primrar S1 och S2, var och en innehållande (i) en 45 nt genspecifik region för homolog recombineering vid 5-änden, följt av (ii) en 27 bp SPA- Cm specifik sekvens vid 3-änden.
- För att konstruera hypomorphic givare mutantstammar, lägga till en C-terminal sekventiell peptid affinitet (SPA) fusion tag, som ofta något påverkar grundläggande protein funktion genom destabiliserande utskrift överflöd (dvs. protein antalet exemplar) eller proteinveckning / aktivitet. För detta ändamål skapa en valbar SPA-tagg (SPA-Cm) DNA-mall genom att omvandla Kan resistensmarkören i pJL148 18 till Cm med hjälp recombineering mellan identiska nukleotidsekvenser som flankerar Kan markör i pJL148 och Cm markör i pKD3 15. Den resulterande mallen består av i-ram-SPA-tagg följt av en Cm resistensmarkör, och är lämplig för PCR-amplifiering, recombineering och efterföljande eSGA 12.
- Bekräftelse och rening av PCR-produkten
- Kontrollera att märkning kassetten korrekt amplifierades genom att utsätta 2-5 pl av PCR-produkten för agarosgelelektrofores och rena den återstående DNA efter tillverkarens standard PCR-rening protokollet (Qiagen). Eluera PCR-produkten i 30 pl sterilt destillerat vatten och späd till ~ 50 ng / pl koncentration. Den reninged produkt kan användas direkt i omvandling (steg 1,5) eller lagras vid -20 ° C i upp till 6 månader tills användning.
- Förbereda HFR Cavalli kompetenta celler för givare konstruktion
- Inokulera en ml av den mättade övernattskultur av en Hfr Cavalli-stam i 70 ml färskt Luria-Bertani (LB)-medium med 35 | il av 50 pg / ml ampicillin i en 250 ml kolv. Inkubera kulturen vid 32 ° C med skakning vid 220 rpm tills en optisk densitet (OD) 600 nm av ~ 0,5-0,6 erhålls (~ 2 timmar).
- Överför kulturen till ett vattenbad för värmeinduktion av λ röda rekombinationssystemet 16 vid 42 ° C under 15 minuter med skakning vid 160 varv per minut. Stoppa induktion genom att överföra kulturen till en kyld is-uppslamning vattenbad under 10-20 min vid 160 varv per minut. Se till att hålla cellerna kalla från denna punkt till efter omvandlingen, använda rör och kyvetter som kylts på is under minst 15 min före användning.
- Dela upp culture lika i 2 förväg kylda 50 ml polypropenrör (~ 35 ml kultur per rör) och centrifugera vid 4.400 xg under 6 min vid 4 ° C.
- Kasta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten genom att försiktigt vända i ~ 50 ml iskallt sterilt destillerat vatten. Centrifugera cellerna igen vid 4.400 x g under 6 min vid 4 ° C. Kasta bort supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten i 20 ml iskall steril 10% glycerol och centrifugera igen såsom beskrivits ovan.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 500 | il iskall 10% glycerol. Alikvotera de preparerade kompetenta celler i 50 pl volymer i enskilda, pre-kylda 1,5 ml mikro-centrifugrör för omedelbar omvandling. Cellerna kan frysas på torris eller i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C i upp till 3 månader. Dock är transformationseffektiviteten störst med nylagade kompetenta celler.
- Transformation
- Tillsätt 100 ng renad PCR-produkt frånsteg 1.3.1 till de behöriga cellerna. Snärta röret och tillåta suspensionen att sitta på is under 5 minuter.
- Överför suspensionen av iskall kompetenta celler och DNA till en i förväg kyld elektroporeringskyvett. Elektroporera cellblandningen med 2,5 kV, 25 mF, 200 ohm inställning i en 2 mm spalt kyvett (dvs om du använder en annan kyvett, se tillverkarens anvisningar för elektroporering inställningar), och omedelbart tillsätt 1 ml rumstemperatur SOC-mediet. Överför elektroporerade cellerna i SOC-medium i ett 15 ml odlingsrör och inkubera vid 32 ° C under 1 timme med orbital skakning vid 220 varv per minut.
- Efter inkubation centrifugeras cellerna vid 4.400 x g under 5 min vid rumstemperatur. Avlägsna ungefär 850 pl av supernatanten, och återsuspendera cellpelleten i den återstående vätskan.
- Sprid cellerna på förvärmda LB-plattor innehållande 17 pg / ml Cm och inkubera vid 32 ° C över natten. Välj två individuella transformantkolonier och ränder på LB-Cm-plattor för mutant bekräftelse. Vi rekommenderar att undvika största transformantkolonier för att minska risken för att plocka stammar med sällsynta suppressor mutationer. Även strimma samma transformanterna på LB-Kan bekräfta att stammarna inte Kan resistenta.
Obs! Eftersom Cm resistensmarkören används för att göra donator stammarna, förväntar vi oss inte att givaren mutanter som Kan resistenta. Genom strimmor av transformanterna på både LB-Kan och LB-cm plattor, ser vi till att givaren mutationen i sig inte på något sätt har orsakat Kan motstånd. Om detta steg inte utfördes och målet mutationerna skulle påverka förmågan hos stammen att överleva på Kan, skulle dubbla mutanter inte göras effektivt med eSGA sedan donerade stammar skulle överleva alla val steg. Detta är bara en försiktighetsåtgärd logiskt steg för att fånga oväntade fenotyper eller andra frågor som kan störa slutförandet av eSGA skärmar. Om detta steg hoppades, andra kontroller would fortfarande identifiera misslyckade skärmar. Emellertid skulle en tidigare upptäckt av en donator som är resistent mot Kan eliminera en rad improduktiva och onödiga steg. Andra möjliga orsaker till en stam att växa på Kan kan till exempel ut antibiotika liksom användningen av en felaktig PCR-produkt eller en stam för omvandling. Alla dessa frågor kan identifieras och behandlas tidigt i förfarandet med hjälp av denna kontroll, vilket inte krävs, men rekommenderas för eSGA.
- Bekräfta icke väsentliga gendeletion (steg 1.6.1) eller essentiell gen hypomorphic mutation (avsnitt 1.6.2)
Obs: När bekräftar gendeletion genom PCR, bör genomiskt DNA från en vildtyp stam användas som en kontroll.- Bekräfta icke väsentliga gendeletion
- För att bekräfta gendeletion genom PCR, isolera det genomiska DNA från de transformerade, förmodade knockout stammar odlade i flytande LB-Cm-medium, efter manufactUReR instruktioner (Promega).
- För att bekräfta framgångsrik recombineering, amplifiera DNA från varje transformant med tre olika uppsättningar av primrar knockout bekräftelse. Utföra reaktionerna med ~ 150 ng genomiskt DNA-templat, och bekräfta de korrekta fragmentstorlekarna genom att köra PCR-syntetiserade produkter på en agarosgel.
- Den första primern består av en 20-nt flankerande primer, belägen 200 bp uppströms om målregionen (KOCO-F) och CM-R-primer, som är komplementär till Cm kassetten sekvensen. Denna förstärkning förväntas producera en 445 nt amplikon i mutanten, men inte i vildtyp-stammen (figur 1).
- Den andra uppsättningen innefattar en framåtriktad primer (Cm-F), hybridisering med Cm kassetten sekvensen, och en 20-nt omvända flankerande bekräftelse primer (KOCO-R), som är utformad för att glödga 200 bp nedströms om 3 '-änden av utgår gen. Denna amplifieringsreaktion förväntas producera en 309 nt amplikon i mutanten, men ingent i vildtypsstammen (figur 1).
- Den tredje PCR innehåller KOCO-F och KOCO-R primers. Denna reaktion är nödvändig för att bekräfta att den valda stammen är inte en merodiploid, med en gen lokus har ersatts av kassetten och ett annat duplicerade men annars vildtyp genkopia fortfarande närvarande. Denna amplifiering från en korrekt deletionsmutant förväntas producera en 1,4 kb produkten (figur 1).
Obs: När målgenen har ungefär samma längd i baspar som gendeletion kassetten, kommer man inte att märka en skillnad mellan ett locus som har ersatts av kassetten, och ett ställe som inte har. För en definitiv bekräftelse i sådana fall rekommenderar vi att du använder extra primers att specifikt amplifiera ett DNA-segment i den borttagna genen. I detta fall, om genen har tagits bort, kommer en amplifieringsprodukt observeras endast i vildtyp kontrollstammen och inte i mutanten. Dessa primrarkan vara manuellt eller beräkningsmässigt utformade att specifikt amplifiera ett segment av DNA inom den deleterade regionen. Vi amplifiera typiskt 140 bp regioner.
- Bekräfta essentiell gen hypomorphic mutation
- För att bekräfta hypomorphic mutationen med PCR, använd genspecifika 20-nt framåt (KOCO-F) och omvänd primer (KOCO-R) ligger 200 bp uppströms och nedströms respektive av SPA-taggen insertionsstället (figur 2).
Anmärkning: Detta amplifieringssteg användes som en kontroll för att säkerställa frånvaron av ett otaggat kopia av målet essentiella genen. När endast en märkt version är närvarande, är ett enda band 310 bp större än SPA-Cm amplikon observerades. En 400 bp produkt skulle signalera närvaron av den omärkta versionen av genen. - Parallellt med PCR-bekräftelse, använd Western blotting för att kontrollera den i ram insättning av SPA-taggen användning av en anti-FLAG-M2-antikropp specifik för FLAG-epitoperna av SPA-tagg 21.
- För att bekräfta hypomorphic mutationen med PCR, använd genspecifika 20-nt framåt (KOCO-F) och omvänd primer (KOCO-R) ligger 200 bp uppströms och nedströms respektive av SPA-taggen insertionsstället (figur 2).
- Bekräfta icke väsentliga gendeletion
- Lagra bekräftade givaren stammen
- Överför natten kultur bekräftade rekombinant givaren mutantstam till de märkta kryokärl, komplettera med glycerol till 15% slutlig koncentration och blanda väl. För långtidsförvaring, hålla kryokärl vid -80 ° C.
2. Ordnande E. coli F-mottagare mutanter för eSGA skärmar
- Replica-pin E. E. coli Keio enda icke-essentiell gen deletionsmutant samling som genereras av Mori et al. (3968 stammar 11, F-BW25113, kan erhållas från Open Biosystems) robot till 24 384-brunnars mikroplattor innehållande 80 pl flytande LB-medium per brunn , kompletterat med 50 pg / ml Kansas
Obs: För att systematiskt utvärdera GIS med essentiella gener kan mottagaren Keio samlingen 11 kompletteras med F-Kan märkt väsentliga gen hypomorphic mutantstammar med C-terminala SPA-taggar 22, 23. - För att göra plats för gränskontroll stammen, som kommer att fungera som en positiv kontroll, stöd inom och mellan plattan normalizations samt automatiserade koloni quantizations, ta bort ympade media från de yttersta brunnarna i varje platta från ovanstående steg och överföring till nya plattor, återigen lämna de yttersta brunnarna tomma.
Obs! Gränskontroll stam JW5028 från Keio samlingen 11 stryks för en liten pseudo-gen som inte ska, och har inte i våra hel-genomet skärmar uppvisar geografiska beteckningar med några givare. Därför är detta en bra positiv kontroll stam för att identifiera sällsynta fall när konjugation, fastlåsning eller markeringar har misslyckats, vilket resulterar i frånvarande eller sporadisk gräns stam tillväxt. Till exempel, om de gränskontroller kolonierna inte växa efter den dubbla mutanten val kan frågan stammen inte kunna konjugering kan konjugering har försökt ina tillstånd som hindrade den från att äga rum (t.ex. på en antibiotika-innehållande plattan), eller en felaktig antibiotika kan ha lagts till valet plattan. Likaså om mycket få, sporadiska kolonier observeras på hela plattan, inklusive gränsen, kan konjugering eller fastlåsning har misslyckats och skärmen måste upprepas. Om denna sporadiska gräns tillväxt är reproducerbar, kan det tyda på genomgående dålig givare konjugering och därmed fall där dubbla mutanter inte efterlevs är möjligen på grund av konjugering fel, inte sant geografiska beteckningar. Sådana skärmar skulle behöva kasseras från ytterligare analys. Genom att vara närvarande på alla plattor tillåter gränskontroll stammen kolonin kvantisering programvara för att automatiskt bestämma koloni positioner på de dubbla mutant plattorna och därmed koloni positioner inte behöver avgränsas manuellt. Slutligen gränskontroller stam stöd i normaliseringen av koloni storlekar inom (t.ex. olika rader i en platta) och between (t.ex. olika mottagare plattor fästs med samma donator vid olika tidpunkter) plattor. - Likaså skapar negativ kontroll fläckar genom att ta bort alla två stammar från en annan plats i varje platta (inte gränsen) och överföra stammarna till en ny platta. Fylla dessa tomma brunnar med LB-media innehållande 17 | ig / ml Cm. Dessa negativa kontroll fläckar förväntas vara tom i mottagaren och därmed dubbla mutant plattor och bidra till att det inte fanns någon behandling eller platta fel hantering vid numrering, avbildning eller sätter plattorna.
Anmärkning: Dessa tomma fläckar krävs negativa kontroller. Negativa kontroller hjälper till att identifiera tillfällen då urvalet misslyckas - när negativa kontroll stammar växa under valet. Vi föreslår att inte bara välja unika negativ kontroll fläckar för varje mottagande plattor, men också välja negativ kontroll fläckar inom samma kvadrant av plattan (t.ex. nere till höger). På detta sätt, mönstretnegativa kontroll fläckar skulle identifiera eventuella platta felhantering fel (t.ex. plattor som felmÀrkta eller är fäst upp och ned, där det övre vänstra kolonin är fäst i nedre högra läge). - Inokulera Keio stammen JW5028 11, med en pseudogen radering, i en 500 ml kolv med 200 ml LB, innehållande 50 ug / ml Kansas Baserat på våra hel-genomet eSGA skärmar är tillväxten av denna mutant närmast vilda typ BW25113 och således som en gränskontroll.
- Odla ordnade stammarna liksom JW5028 kultur över natten vid 32 ° C med 190 rpm omloppsbanor skakar till en OD av ~ 0,4 till 0,6 vid 600 nm. Efter odling över natten, fyll i gränstrakterna brunnar med ca 80 pl JW5028 natten kultur.
- De sammansatta plattorna kan användas i steg 3,2. Alternativt, för långtidslagring, komplettera varje brunn i de mottagande plattorna med 15% glycerol, blanda media och glycerol, och hålla plattornavid -80 ° C.
3. Hög densitet Strain Parning förfarande för generering E. coli dubbla mutanter
- Odla stammen Hfr givaren, med frågan mutationen, märkt med Cm, över natten vid 32 ° C i rikt LB-Cm vätskemedium (17 pg / ml av Cm) med skakning vid 220 varv per minut.
- Nåla den beställda mottagaren mutanta samling 384-koloni densitet på fasta LB-plattor kompletterade med 50 | ig / ml av Kansas Parallellt stift givaren frågan mutantstammen i 384-koloni densitet på samma antal LB-plattor, kompletterade med 17 | ig / ml Cm. Inkubera plattorna över natten vid 32 ° C.
Obs! Mottagande plattor som används för fastlåsning kan kräva upp till 36 timmar för att erhålla tillräckligt stora kolonier för efterföljande steg. När genomsnittlig gräns koloni storlek är ca 2 mm i diameter (eller senare), plattorna är redo att nålas. - Att konjugera stammarna, stift givaren från 384-koloni natten givare plattan påtill fast LB-platta. Därefter stift en enda 384-koloni mottagande platta över den färska nålas givare på konjugering plattan. Fortsätt fastlåsning tills alla givare och mottagare plattor har konjugerats genom att fästa på fasta LB konjugering. Inkubera fästs konjugeringsförfaranden plattorna vid 32 ° C under 16 till 24 timmar.
Obs: Enskilda enkelmutanten givare stammar kan visa gen-till-gen variation i parning effektivitet på grund av de potentiella effekterna av mutationer på konjugering, DNA-överföring effektivitet, eller fitness. Tillväxten kan stoppas när som helst mellan 16 och 24 timmar, då tillräckligt stora kolonier har erhållits för efterföljande fastlåsning steg. Konjugationer varar 16 till 24 timmar producera tillräckliga mängder ex-conjugants för reproducerbara eSGA resultat även för mutanterna av sena överföra gener eller mutanter med något lägre kondition. - Pin varje 384-densitet konjugering platta på en enda fast LB-platta, innehållande Cm (17 pg / ml) och Kan (50ig / ml) tills alla konjugeringstekniker plattorna har fästs. Inkubera de nyligen-fästs första urval plattor för 16-36 timmar vid 32 ° C.
Obs! Gäller urvals steg kan olika mycket tid behövas för olika givare skärmar. Eftersom alla dubbla mutanter i en given skärm har samma donator mutation i genomsnitt ger en långsammare växande givare mutant upphov till långsammare växande dubbla mutanter. Således, beroende på givarens kondition, kan selektionssteg kräva mellan 16 och 36 timmar. Den dubbla mutanten tillväxt kan stoppas när de dubbla mutanterna är tillräckligt stora för det efterföljande steget antingen sätter efter den första val eller avbildning efter den andra. Detta översätter vanligtvis gränskontroll kolonier i genomsnitt med minst 2 mm diameter. - Re-pin varje första val platta till en andra, dubbel läkemedel (Cm och Kan), val plattan i 1536-koloni-format, så att varje första val koloni representeras av fyra kolonier påden andra markeringen plattan. Inkubera plattorna under 16-36 timmar vid 32 ° C. Fotografera slutliga dubbla mutanta selektionsplattor att kvantitativt mäta tillväxten lämplighet av mutanten och att analysera interaktioner mellan genpar (Figur 3).
Obs: Även om frekvensen av merodiploidy (partiella kromosomala dubbleringar) är låg på cirka 1/1, 000 celler 24, kan merodiploidy dölja GI. Därför rekommenderar vi även biologisk replikerar i alla eSGA skärmar. Lyckligtvis kan kommersiella engångstallrikar och plast fastlåsning dynor återanvändas upp till tre gånger genom sterilisering av material enligt följande: Agar från plattorna kasseras och plattorna samt bindor steriliseras genom att blötlägga dem i 10% blekmedel under natten, följt av en skölj med destillerat vatten, tvättning i 70% etanol, och lufttorkning av plastartiklar i ett dragskåp under ultraviolett ljus. De sterila kuddar och plattor lagras i förslutna sterila plastpåsar tills användning.
4. Databehandling och Härledning GI poäng
- Mät kolonier på varje platta i batch-läge eller individuellt med hjälp av en specialiserad mjukvara koloni avbildning 3, 9.
Obs: En lämplig Java-baserad hög genomströmning koloni avbildning och scoring ansökan är nu fritt tillgänglig för allmänhetens tillgång ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). Programvaran fungerar på olika plattformar (dvs. Mac eller PC) och kan startas antingen som en körbar eller ett terminalfönster. - Normalisera råa mätningar kolonistorlek genom att korrigera för systematiska fel inom och mellan plattor såsom effekter plåtkanten, mellan plattorna effekter variation, ojämn bild belysning, artefakter på grund av fysiska krökning agarytan, effekter konkurrens för angränsande kolonier och eventuella fastlåsning fel , liksom skillnader i tillväxt tid
- Kolonierna i kanten rader och kolumner tenderar att vara större på grund av lägre konkurrens om näringsämnen än finns i mitten av plattan. Således, för att korrigera för denna effekt, skala storleken på kanten kolonier vara sådan att den medianstorlek i den raden eller kolumnen är lika med medianstorlek av kolonierna i mitten av plattan.
- Analysera resultaten statistiskt att ta hänsyn till reproducerbarhet och standardavvikelsen variansen från medianen storlekarna av de likadana colony mätningarna. Minst tre oberoende biologiska upprepade experiment för att kunna bedöma den experimentella reproducerbarhet.
- Slutligen använder de normaliserade median koloni storlekar tillväxt fitness för att generera ett GI poäng (S) för varje gen par med hjälp av följande formel:
n 1 "src =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
Där S = var (var Exp x (n Exp -1) + var Cont x (n kont -1)) / (n Exp + n Cont -2), var Exp = den maximala variansen av de normaliserade koloni storlekarna för dubbelmutant, var Cont = medianen av variationer i de normaliserade dubbelmutant koloni storlekar från referensuppsättningen, n Exp = antal mätningar av dubbla mutant koloni storlek, n Cont = median antal experimentella replikat över alla experiment, μ Exp = median normaliserade koloni storleken på de dubbla mutanterna, och μ Cont = medianen av normaliserade koloni storlekar för alla dubbla mutanter som härrör från samma donator mutantstammen. S-betyget reflekterar både den statistiska förtroende av en förmodad digenic interaktion såväl som den biologiska styrkan av interaktionen. Starka positiva S-poäng indikerar lindra effekter, suggesting att de samverkande generna deltar i samma väg 9, medan betydande negativ S-poäng speglar syntetiska sjukdom eller dödlighet, som ofta är suggestiv av medlemskap i parallella redundanta vägar 9. För att bestämma väg nivå funktionella relationer, en enda S-poäng för varje par av testade gener som produceras från den slutliga databasen.
Obs: I vår tidigare studie 9, fann vi att rekombination tenderar att inträffa mer sällan mellan gener inom 30 kbp av varandra. Därför, för efterföljande analys, efter normalisering och värdering generering, tar vi interaktioner mellan gener inom 30 kbp av varandra. Förutom geografiska själva, kan funktionella samband mellan par av gener undersökas genom att titta på hur lika GI profilerna av de två generna är. GI profilen av en gen är en uppsättning av alla interaktioner i den genen med alla andra gener i genomet utanförgenens koppling område. Funktionellt liknande gener tenderar att ha högre korrelationer av genetiska Interaktionsprofilerna 12, 25. Således, genom att beräkna korrelationskoefficienter för alla gener i den experimentella datauppsättningen kan man använda eSGA för att undersöka funktionella relationer även mellan gener liggande nära varandra på kromosomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en stegvis protokoll för att använda robotar eSGA screening för att undersöka bakteriella genfunktioner på väg nivå genom förhör GI. Detta tillvägagångssätt kan användas för att studera enskilda gener samt hela biologiska system i E. coli. Försiktigt köra de experimentella stegen som beskrivs ovan, inklusive alla lämpliga kontroller, och strikt analysera och självständigt validera GI uppgifterna är viktiga aspekter för framgång eSGA i att göra nya funktionella upptäckter. Förutom eSGA, ett begreppsmässigt liknande metod för att studera GI i E. coli, kallas jätte-coli 17, kan användas för att belysa nya funktionella relationer som ofta missas av andra metoder, såsom proteomik 23 eller fenotypiska 13 skärmar ensam. Men som med alla genomet-omfattande strategi, existerar begränsningar för tillämpligheten av eSGA eller jätte-coli, till exempel för andra bakteriearter. Detta är delvisorsaken till avsaknaden av genomet hela enkelmutanten gendeletion stam samlingar för de flesta bakteriearter, speciellt för arter där riktade mutagenes hindras av en låg egenfrekvens homolog rekombination. I sådana fall, kan genen störningar med användning av metoder såsom slumpmässiga spårbara mutagenes-baserade analyser som TnSeq 31 potentiellt användas för att undersöka bakteriella genfunktioner. För en översikt av nya alternativa bakteriella genetisk screening förfaranden, se recension papper av Gagarinova och Emili (2012) 32.
Även GI metoder ofta avslöjar många intressanta kopplingar som tyder på nya mekanistiska länkar, integration av dessa data med annan information såsom fenotypisk profilering 13, fysisk interaktion nätverk 22, 23, och GC-inferred associationer kan vara särskilt informativa. Till exempel, såsom med GI nätverk, GC föreningar, som är baserade på bevarandegen ordning (operon), bakteriella genfusioner, operon rekombination frekvenser som härrör från intergena avstånd förväntade operoner över genom, kan liksom fylogenetisk profilering 33 ytterligare insikter i hur en bakteriecell organiserar proteinkomplex i funktionella vägar att förmedla och samordna stora cellulära processer 12, 23.
E. coli är en arbetshäst modell för att förstå den molekylära biologin hos andra gramnegativa bakterier. För detta ändamål kan eSGA GI data användas tillsammans med jämförande genomik information (t.ex. fylogenetiska profilering, profilering av genuttryck) för att undersöka den evolutionära bevarande av funktionella samband som upptäckts av eSGA över andra proteobacterial arter och Prokaryot taxa. Vidare interaktionsdata genereras för E. E. coli kan användas för att få insikt i vägen arkitektur mikrober upptäcktes av metagenomikrofoner, som funktionella anteckningar saknas. Eftersom många gener är allmänt konserverad över alla mikrober 23, och eftersom antibiotika känslighet kan förbättras genom vissa genetiska störningar 34, kan de funktionella sambanden belyses av eSGA även eventuellt utnyttjas för att utforma innovativa terapier kombinationsläkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Genome Canada, Ontario Genomics Institute och den kanadensiska Institutes of Health Research bidrag till JG och AE AG är mottagare av Vanier Kanada Graduate Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| I. Antibiotics | |||
| Chloramphenicol | Bioshop | #CLR201 | |
| Kanamycin | #KAN201 | ||
| Ampicillin | # AMP201 | ||
| 2. Luria-Bertani medium | |||
| LB powder | Bioshop | #LBL405 | |
| Agar | Bioshop | #AGR003 | |
| 3. Bacterial Strains and Plasmids | |||
| Hfr Cavalli strain λred system (JL238) | Babu et al.14. | ||
| pKD3 | E. coli Genetic Stock Centre, Yale | ||
| Keio E. coli F- recipient collection | National BioResource Project (NBRP) of Japan11 | ||
| Hypomorphic E. coli F- SPA-tag strains | Open biosystems; Babu et al.14 | ||
| 4. Primers | |||
| pKD3-based desalted constant primers | F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3' R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3' |
||
| Desalted custom primers | Cm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3' Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3' |
||
| Desalted custom primers | F2 and R2: 20 nt constant regions based on pKD3 sequence and 45 nt custom homology regions F2 constant region: 5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3' R2 constant region: 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'S1 and S2: 27 nt constant regions for priming the amplification of the SPA-Cm cassette and 45 nt custom homology regions S1 constant region: 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3' S2 constant region: 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3' KOCO-F and KOCO-C: 20 nt primers 200 bp away from the non-essential gene deletion site or the essential gene SPA-tag insertion site |
||
| 5. PCR and Electrophoresis Reagents | |||
| Taq DNA polymerase | Fermentas | # EP0281 | |
| 10X PCR buffer | Fermentas | # EP0281 | |
| 10 mM dNTPs | Fermentas | # EP0281 | |
| 25 mM MgCl2 | Fermentas | # EP0281 | |
| Agarose | Bioshop | # AGA002 | |
| Loading dye | NEB | #B7021S | |
| Ethidium bromide | Bioshop | # ETB444 | |
| 10X TBE buffer | Bioshop | # ETB444.10 | |
| Tris Base | Bioshop | # TRS001 | |
| Boric acid | Sigma | # T1503-1KG | |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | Sigma | # B6768-500G | |
| DNA ladder | NEB | #N3232L | |
| 6. DNA isolation and Clean-up Kits | |||
| Genomic DNA isolation and purification kit | Promega | #A1120 | |
| Plasmid Midi kit | Qiagen | # 12143 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | #28104 | |
| 7. Equipment for PCR, Transformation and Replica-pinning | |||
| Thermal cycler | BioRad, iCycler | ||
| Agarose gel electrophoresis | BioRad | ||
| Electroporator | Bio-Rad GenePulser II | ||
| 0.2 cm electroporation cuvette | Bio-Rad | ||
| 42 °C water bath shaker | Innova 3100 | ||
| Beckman Coulter TJ-25 centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 32 °C shaker | New Brunswick Scientific, USA | ||
| 32 °C plate incubator | Fisher Scientific | ||
| RoToR-HDA benchtop robot | Singer Instruments | ||
| 96, 384 and 1,536 pin density pads | Singer Instruments | ||
| 96 or 384 long pins | Singer Instruments | ||
| 8. Imaging Equipments | |||
| Camera stand | Kaiser | ||
| Digital camera, 10 megapixel | Any Vendor | ||
| Light boxes, Testrite 16" x 24" units | Testrite | ||
| 9. Pads or Plates Recycling | |||
| 10% bleach | Any Vendor | ||
| 70% ethanol | Any Vendor | ||
| Sterile distilled water | Any Vendor | ||
| Flow hood | Any Vendor | ||
| Ultraviolet lamp | Any Vendor | ||
| 10. Labware | |||
| 50 ml polypropylene tubes | Any Vendor | ||
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Any Vendor | ||
| 250 ml conical flaks | VWR | # 29140-045 | |
| 15 ml sterile culture tubes | Thermo Scientific | # 366052 | |
| Cryogenic vials | VWR | # 479-3221 | |
| Rectangular Plates | Singer Instruments | ||
| 96-well and 384-well microtitre plates | Singer Instruments | Nunc | |
| Plate roller for sealing multi-well | Sigma | #R1275 | |
| plates | ABgene | # AB-0580 | |
| Adhesive plate seals | Fisher Scientific | # 13-990-14 | |
| -80 °C freezer | Any Vendor | ||
References
- Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065 (2008).
- Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
- Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
- Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
- Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
- Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
- Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
- Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377 (2011).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
- Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
- Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
- Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
- Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
- Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
- Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
- Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
- Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
- Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135 (2008).
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
- Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
- Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
- Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
- Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
- St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).
