As formulações para liofilização de bactérias e sua influência na sobrevivência das células

Summary

Liofilização é muitas vezes uma forma fácil e conveniente de obter produtos secos de células bacterianas viáveis. Uma questão do processo é a sobrevivência da célula. Nós detalhe aqui um processo para investigar a forma como a sobrevivência das células durante a liofilização é influenciada pelas propriedades da formulação utilizada.

Abstract

Cellular água pode ser removida para inactivar reversivelmente microorganismos para facilitar o armazenamento. Um tal método de remoção é a liofilização, que é considerado um método de desidratação suave. Para facilitar a sobrevivência das células durante a secagem, as células são frequentemente formuladas anteriormente. A formulação forma uma matriz que incorpora as células e protege-los a partir de várias tensões impostas nocivos sobre as células durante a congelação e secagem. Apresenta-se aqui um método geral para avaliar a taxa de sobrevivência das células após a liofilização e demonstramos pela comparação dos resultados obtidos com quatro formulações diferentes: a sacarose, o dissacárido sacarose derivada polímero Ficoll PM400, e os respectivos polissacáridos hidroxietil celulose (HEC ) e hidroxipropil-metil-celulose (HPMC), em duas estirpes de bactérias, P. putida KT2440 e A. A6 chlorophenolicus. Neste trabalho, ilustram como preparar formulações para liofilização e como para investigar o mecaismos de sobrevivência celular após a reidratação, caracterizando a formulação utilizando de calorimetria exploratória diferencial (DSC), medições de tensão superficial, análise de raios-X e microscopia eletrônica e relacionar esses dados com as taxas de sobrevivência. Os polímeros foram escolhidas para obter uma estrutura monomérica do respectivo polissacarídeo sacarose assemelhando-se a um em graus variados. Usando este método de instalação que mostrou que os polímeros podem suportar a sobrevivência celular tão eficazmente como dissacarídeos se certas propriedades físicas da formulação é controlada ^1.

Protocol

1. Cultivo e colheita de P. putida

1. Prepara-se uma cultura iniciadora de Pseudomonas putida, por inoculação de 100 mL de caldo de soja tríptica (TSB) com uma colónia de P. putida células cultivadas em agar suplementado com caldo de soja tríptico (TSA). Manter a cultura a 30 ° C em uma placa de agitação fixada em 130 rpm.
2. Após 7 hr transferir uma parte alíquota da cultura iniciadora equivalente a 1/10 do volume final da cultura principal para TSB-meio fresco. Manter as células a 30 ° C em uma placa de agitação a 130 rpm durante 16 horas.
3. Após 16 horas de crescimento, as células são colhidas por fiação a cultura de células a 1.500 xg durante 20 min à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e lava-se as células re-suspendendo a pelete celular é uma solução de NaCl que é isotónica com o meio de crescimento. Neste caso, foi utilizada uma solução de NaCl 150 mM. As células são, então, centrifugadas mais uma vez e o sobrenadante é decantado antes de ressuspensão das células em meio de formulação,veja o passo 3.2.

2. Cultivo de outras espécies

1. Para adaptar o protocolo para outras espécies bacterianas os procedimentos de cultivo e colheita deve ser alterado de acordo com as exigências da espécie. Para evitar choque osmótico das células durante o manuseamento durante a colheita e a etapa de lavagem (s), a osmolalidade das soluções deve corresponder ao do meio de crescimento no momento da colheita.

3. Formulação de células

1. Preparar as soluções de formulação por pesagem para os respectivos componentes da matriz e que se dissolvem em água. Para atingir as condições isotónicas, ou ajustar a quantidade de excipiente ou adicionar NaCl ou algum outro soluto compatível célula alcançar a osmolaridade desejada. Para as substâncias com baixo peso molecular, tais como as quantidades dissacarídeos pode ser facilmente ajustado para alcançar condições isotónicas. Para substâncias como polímeros que são de elevado peso molecular, a tonicidade deve ser ajustada de modo compatível com a célulaalaúdes, por exemplo, NaCl ou dissacarídeos. Note-se que a adição de qualquer substância irá influenciar as propriedades físicas da formulação, o que, por sua vez, podem influenciar o comportamento de secagem por congelação e sobrevivência celular.
2. Decantar a solução de lavagem (neste caso de NaCl) e re-suspender as células nos respectivos meios de formulação.
3. Certifique-se de que as células são homogeneamente dispersa. Formulações de baixa viscosidade são agitadas enquanto formulações de viscosidades mais elevadas são misturados usando pela adição, por ex., Uma barra de agitação e agitando o recipiente até que a mistura homogénea é atingida.
4. Separe as formulações em frascos liofilizador. Os frascos devem ser pesadas vazias, com a amostra antes e após a criodessecagem para calcular a quantidade de água removida durante a liofilização.
5. Adicionar rolhas de borracha para os frascos se os frascos devem ser selado dentro do liofilizador, consulte o passo 4.3.
6. Enumere as células em cada formulação antes da liofilização, consulte a etapa 6.
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4. Liofilização

1. As condições de secagem por congelação têm de ser ajustados para as propriedades físicas da formulação. O parâmetro mais importante é, neste caso, a temperatura de transição vítrea, Tg, da formulação, denotada Tg 'para a amostra crioconcentrada para indicar que a água ainda está presente. A Tg 'da formulação crioconcentrada é facilmente medida por calorimetria de varrimento diferencial (DSC), ver o passo 7.
2. Ajustar os parâmetros do processo de liofilização de modo a que a temperatura da amostra é sempre abaixo da Tg da amostra e que a pressão na câmara permite um rápido sublimação do gelo, ou seja, a secagem primária e a água residual na formulação, isto é, derivado secagem. Se a temperatura da amostra é acima da Tg ', durante o processo de secagem não é um grande risco de colapso estrutural da amostra, que podem diminuir significativamente a sobrevivência celular.
3. Para proteger os produtos secos após freeze-secagem a atmosfera da amostra tem de ser controlada. Se possível, selar as amostras no liofilizador antes de o vácuo é libertado no final do ciclo de secagem por congelação. Alternativamente, os frascos podem ser preenchido com uma atmosfera preferido. É importante evitar a exposição das amostras para as condições ambientais como a humidade ou o oxigénio presente na atmosfera de armazenamento irão influenciar a sobrevivência das células.
4. Pesar os frascos.

5. Reidratação

1. Rehidratar as amostras com água desionizada e estéril. A quantidade de água a ser adicionada deve ser a mesma que a quantidade removida durante a liofilização e é calculado a partir do peso do frasco vazio, o mesmo frasco com a amostra antes e após a liofilização. Vortex as amostras de vez em quando, em seguida, até as soluções aparecem homogênea.

6. Enumeração

1. Desenhar 100 ul de cada amostra e fazer 10 diluições em série. A partir das diluições de inte100 l resto é revestida em placas de TSA. As placas são incubadas à temperatura e tempo requerido.

7. Caracterização da formulação do comportamento de congelamento

1. Pegue uma pequena quantidade, 5 - 10 mg, da amostra e colocá-lo em uma panela DSC-alumínio com tampa. Prepare uma panela vazia como referência.
2. Definir o programa de verificação de temperatura DSC. O programa de arrefecimento é ajustado para imitar o passo de congelação no programa de liofilização. Isto é feito, como a cinética de arrefecimento pode influenciar a Tg 'das formulações hidratadas. Antes do exame de aquecimento começa reduzir a temperatura bem abaixo da Tg esperado 'das formulações investigadas, normalmente -100 ° C.
3. Escolher uma taxa adequada de aquecimento, normalmente, uma taxa de aquecimento de 5 - 40 ° C / min é usada. O sinal de fluxo de calor registada é expressa em watts e será influenciada pela taxa de aquecimento. A taxa de aquecimento maior irá dar um sinal maior de Tg.
4. Defina o intervalo de temperatura para que eut abrange tanto Tg 'ea fusão da formulação.

8. As medições de tensão de superfície das formulações hidratadas

1. A configuração experimental utilizado nesta experiência é de acordo com o método para medir du NOUY superfície.
2. Limpar o anel de platina e o vaso de medição com cuidado. O navio é lavado com acetona, limpou com um pano que não solte fiapos, e depois queimado no interior com uma chama incolor. O anel brilha em vermelho em uma chama incolor.
3. Encha o copo com a solução e deixar a superfície resolver antes da medição. Para soluções, onde o estado de equilíbrio é atingido apenas após um longo período de tempo, por exemplo, polímeros, a configuração simples usado aqui irá fornecer dados qualitativos.
4. Para as formulações com elevadas viscosidades, por exemplo, soluções de 2% (w / w) de HEC ou HPMC, a tensão superficial tem de ser medida em soluções de concentrações mais baixas e, em seguida, extrapolada. Isto pode ser feito, aproveitando o factoà diminuição dos níveis de tensão superficial de folga em concentrações inferiores a 0,5% (w / w).

9. Análise de raios X das formulações secas

1. Pegue uma pequena quantidade de matriz / bactérias e carregá-lo em um porta-amostras.
2. Monte o suporte de amostras para o X-ray-difratômetro.
3. Para analisar qualquer fase cristalina presente na amostra, o pacote de programas de EVA da Bruker pode ser usado.

10. Microscopia Eletrônica

1. Pegue uma pequena quantidade de matriz / bactérias para fora dos frascos e corrigi-lo em um suporte de SEM.
2. Carregue o titular SEM no crepitar-coater (Thermo polaron VGScientific SC7640 utilizado no presente trabalho) e casaco da amostra com alguns nm de Au / Pd ou Pt. Nestas experiências, os parâmetros de pulverização foram: 1900 V, 20 mA, e 20 seg, para a ~ 5 - 10 nm revestimento Au / Pd. O revestimento reduz a carga elétrica, durante a aquisição da imagem. Recomenda-se começar com uma camada fina e, se o carregamento persiste e provoca imagemartefactos, a amostra deve ser revestido novamente.
3. Carregar o titular SEM SEM na câmara. Selecione os parâmetros de imagem apropriados. Para o instrumento utilizado na Figura 2 (FEI Strata DB235), foram utilizados 5 kV voltagem de aceleração, spotsize 3, a uma distância de trabalho de 5 mm e o detector de electrões secundários.
4. Opcionalmente, é possível a utilização de feixe de iões focado para cortar secções transversais das bactérias incorporados no polímero para revelar mais pormenores.

Representative Results

A Tabela 1 mostra dados sobre a composição da formulação, eventos gravados térmicas por DSC durante o aquecimento das formulações congeladas, a estrutura das amostras secas e a tensão superficial das soluções de formulação. A T _g »de sacarose ter sido determinada a -40 ° C, ^{2, 3} e pode ser difícil de detectar concentrações de sacarose para abaixo de 20% w / w. A ocorrência térmica a -35 ° C, é, provavelmente, relacionado com o aparecimento de dissolução do gelo ^2. A estrutura cristalina detectada por raio-X no HEC e amostras de HPMC e também visto em SEM (ver Figura 2b, e 2c) coincidem com a forma do cristal de NaCl normal.

A Figura 1A mostra os dados de sobrevivência para o P. Gram-negativas putida e A. Gram-positivos chlorophenolicus formulado nas diferentes formulações à base de sacarídeos. Note-se que a tendência na forma como as formulações suporta a sobrevivência da célula é o mesmo para boª espécies de bactérias. O gráfico mostrado na Figura 1B ilustra a correlação entre a sobrevivência a liofilização e as tensões superficiais das formulações.

A Figura 2 mostra imagens SEM-das formulações secas. Para as quatro polímeros mostrados aqui, a matriz formada tem a aparência de "papel branco": folhas lisas interligadas em que as bactérias são incorporados e aparecem como caneluras. Para Ficoll e sacarose, as folhas são de cerca de 1 mm de espessura e de 10 - 20 m de largura, com Ficoll tem uma superfície lisa. HPMC e HEC formar folhas de espessura muito reduzida, possivelmente devido ao facto de a quantidade de polímero é menor nestas formulações à base de celulose, em que as outras (Tabela 1). Além disso, os cristais de sal foram observados para HEC e HPMC, com este último a exibir uma maior quantidade de precipitados sobre a superfície das folhas de polímero. As bactérias são mais facilmente visto nas formulações à base de celulose, porque as folhas são thinterior. Em sacarose e Ficoll, eles são principalmente observada como ondulação das superfícies lisas de outro modo.

Composição Formulação	Eventos térmicos detectada nas formulações congeladas	Estrutura de formulação seca	A tensão superficial de formulações não desidratadas (mN m -1)
10% de sacarose	aparecimento de dissolução de gelo, -35 ° C	sacarose amorfo	72 ± 0,1
10% de Ficoll, 150 mM de NaCl	T G ', de -22 ° C	Ficoll amorfo	68 ± 0,3
2% de HEC, 150 mM de NaCl	fusão eutética de gelo e de NaCl, -28 ° C	HEC amorfo, NaCl cristalino	64 ± 0,6
2% de HPMC, 150 mM de NaCl	fusão eutética de gelo e de NaCl, de -27 ° C	52 ± 0,8

Tabela 1. A composição das diferentes formulações e propriedades das formulações aquosas ou seco. As concentrações de polímero da HEC e HPMC foram maximizadas para alcançar uma cobertura matriz espessura suficiente da bactéria mas tem ainda uma solução viável no que se refere à viscosidade.

Figura 1. A) As taxas de sobrevivência de liofilizadas P. putida (branco) e A. chlorophenolicus (cinzento) quando formulados em soluções com base no dissacárido sacarose, ou os polímeros de Ficoll, e HPMC HEC, B) Correlação entre a sobrevivência das células após a liofilização e a tensão superficial das formulações secas por un.

Figura 2. MEV de P. putida em quatro formulações diferentes: a) sacarose, b), Ficoll c) HEC, d) de HPMC. As bactérias são difíceis de ver em a) e b), pois a folha de polímero são bastante espesso e pode envolver as bactérias completamente, em c) e d) as bactérias aparecem com mais destaque na superfície. Em d), que podem ser distinguidas a partir da grande quantidade de sal precipita devido à sua forma e do contraste, que aparecem como oblongas, corpúsculos escuras.

Discussion

A motivação para este estudo foi investigar algumas propriedades de formulação que podem ser de grande importância para a sobrevivência da célula durante a liofilização. Embora a tolerância secagem intrínseco varia entre as diferentes espécies, tal como ilustrado na Figura 1A, a tendência de quão bem a formulações diferentes suporte a sobrevivência das células é semelhante. É informativo começar com uma comparação de sacarose e Ficoll. Acredita-se que um factor-chave para uma formulação para apoiar a sobrevivência das células é a capacidade da formulação de ingrediente (s) para substituir a água durante a desidratação, mantendo, assim, a estrutura das proteínas e das membranas da célula, também no estado seco. Dissacarídeos como a sacarose, mas também trealose mostrar esta propriedade, enquanto polímeros, tais como o amido polissacarídeo não ^5,11. Os polímeros são considerados demasiado grande para interagir com os lípidos da membrana da mesma maneira como dissacarídeos. Outra propriedade importante para o sucesso do liofilizadomento de microrganismos é a capacidade da matriz de suporte para vitrificar (isto é, tornar-se sólidos amorfos.) durante a liofilização. A estrutura amorfa é benéfico para blindagem e manter as células foram separadas. Curiosamente, ambos os dissacarídeos e polímeros vitrificar facilmente se a liofilização é adequadamente realizada. Os nossos resultados mostram que tanto a sacarose e formulações à base de Ficoll tornar amorfo após liofilização, ver Tabela 1, e a sobrevivência das células de suporte igualmente bem. No entanto, existem diferenças significativas entre os dois sacarídeos. Em contraste com a sacarose, a molécula de Ficoll seja, com um peso molecular de 400 kDa, demasiado grande para substituir a água nas interacções com membranas lipídicas durante a liofilização ^{4, 5.} Além disso, como as moléculas de Ficoll são impedidas de o espaço periplasmático das bactérias Gram-negativas, mais uma vez devido ao seu tamanho ^6, a absorção celular de Ficoll é improvável. Com base nisso, sugerimos que o efeito protetor provided pela formulação de sacarose não é primariamente devido à absorção celular do dissacarídeo, importante para a capacidade de substituir a água das estruturas intracelulares ^{7, 8.} Em vez disso, a capacidade de Ficoll para apoiar a sobrevivência da célula tem a ver com as propriedades comuns tanto à formulação de Ficoll e sacarose, por exemplo, a estrutura amorfa.

Focando nos polímeros, é evidente a partir da Figura 1A que a capacidade das formulações de polímeros para apoiar a sobrevivência das células varia. A análise de raios-X mostrou que o NaCl cristalizado durante a liofilização e coexistem com a estrutura amorfa contrário das formulações de HEC e HPMC. Nenhum material cristalino foi detectado na formulação à base de Ficoll. NaCI podem formar complexos com os radicais hidroxilo em hidratos de carbono ^{9, 10.} Em formulações à base de Ficoll e HEC a razão molar de NaCl a fracção hidroxilo foi 1:11 e 1:1, respectivamente, explicando porque não foi detectada cristalizaçãona formulação à base de Ficoll. A separação de fases entre o NaCl e os polímeros de celulose também foi observado nas investigações DSC-. Uma fusão eutética foi registada durante o aquecimento do HEC congelado e HPMC-formulações, indicando que a separação de fase ocorre no estado congelado. A morfologia ea microestrutura da formulação é revelada por imagem MEV (Figura 2) e confirma os dados de raios-X e DSC. As células bacterianas são vistas salientes das folhas com os cristais depositados NaCl claramente visíveis sobre a superfície das folhas de HEC. Com base na similaridade entre as taxas de sobrevivência para as bactérias formulados nas soluções de HEC e de solução de Ficoll-em comparação com o HPMC, concluímos que o estado do sal, se na forma de cristais dispersos ou dissolvidos no polímero, não tem correlação com a sobrevivência da célula. Em vez disso a sobrevivência da célula apresenta uma relação com a tensão superficial das formulações, ver Figura 1B. Para tensões superficiais mais baixas, ltaxas de sobrevivência ower são registradas para as bactérias. De notar contudo que a tensão de superfície medida apresenta a interacção entre os solutos, por exemplo sacarose e os polímeros e a molécula de solvente. Ainda assim, permite uma especulação indirecta que a actividade de superfície de polímeros pode ser relacionado com a sua tendência para interagir também com as superfícies das células de um modo desestabilizador. Como a concentração dos solutos aumenta durante a congelação, os efeitos negativos podem ser potenciados explicar porque o efeito negativo dos polímeros activos de superfície não foram observados quando somente armazenar as bactérias nas formulações inteiramente hidratantes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll PM 400	GE-healthcare	17-0300-10
HEC (Natrosol-M Pharm Grade)	Ashland		Gift from Ashland
HPMC (Methocel F4M)	Dow		Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University
Sucrose	Sigma-Aldrich	S2395
NaCl	Sigma-Aldrich	71376
Tryptic Soy broth	Merck	105459
Tryptic Soy Agar	Merck	105458
Lyostar II	FTS Kinetics	N.A.
Pyris Diamond DSC	Perkin-Elmer	N.A.
Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer	Bruker	N.A
Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM	FEI	N.A
Krüss Educational Tensiometer	Krüss	N.A.