Summary
La lyophilisation est souvent un moyen facile et pratique d'obtenir des produits secs de cellules bactériennes viables. Un problème de ce processus est la survie cellulaire. Nous détaillons ici une procédure pour étudier comment la survie des cellules pendant la lyophilisation est influencée par les propriétés de la formulation utilisée.
Abstract
Eau cellulaire peut être retiré pour inactiver les microorganismes réversible pour faciliter le stockage. Une telle méthode de suppression est la lyophilisation, qui est considéré comme une méthode de déshydratation douce. Pour faciliter la survie des cellules pendant le séchage, les cellules sont souvent préparées à l'avance. La formulation forme une matrice qui intègre les cellules et les protège contre divers stress nuisibles imposées sur les cellules lors de la congélation et le séchage. Nous présentons ici une méthode générale pour évaluer le taux de survie des cellules après lyophilisation et nous l'illustrons en comparant les résultats obtenus avec quatre formulations différentes: le saccharose disaccharide, le saccharose dérivé polymère Ficoll PM400, et les polysaccharides respectifs hydroxyéthylcellulose (HEC ) et de l'hydroxypropyl méthyl cellulose (HPMC), sur deux souches de bactéries, de P. putida KT2440 et A. A6 chlorophenolicus. Dans ce travail, nous illustrons comment préparer des formulations pour la lyophilisation et la façon d'enquêter sur la mécaniqueismes de la survie des cellules après réhydratation en caractérisant la formulation en utilisant la calorimétrie différentielle à balayage (DSC), les mesures de tension de surface, analyse aux rayons X et microscopie électronique et concernant ces données à taux de survie. Les polymères ont été choisis de façon à obtenir une structure monomère de la saccharose ressemblant à de polysaccharide correspondant à un des degrés divers. En utilisant cette méthode setup nous avons montré que les polymères peuvent soutenir la survie cellulaire aussi efficacement que disaccharides si certaines propriétés physiques de la formulation sont contrôlées 1.
Protocol
1. La culture et la récolte de P. putida
- Préparer un levain de Pseudomonas putida par inoculation de 100 ml de bouillon de soja tryptique (TSB) avec une colonie de P. putida cellules cultivées sur agar supplémenté avec du bouillon de soja tryptique (TSA). Gardez la culture à 30 ° C sur une planche en secouant fixé à 130 rpm.
- Après 7 h de transférer une fraction aliquote de l'équivalent de levain à 1/10 du volume final de la culture principale pour BST-milieu frais. Gardez les cellules à 30 ° C sur une planche en agitant à 130 rpm pendant 16 heures.
- Après 16 h de croissance, les cellules sont récoltées par centrifugation de la culture cellulaire à 1500 g pendant 20 min à température ambiante. Décanter le surnageant et laver les cellules par remise en suspension du culot cellulaire se trouve dans une solution de NaCl qui est isotonique pour le milieu de croissance. Dans ce cas, une solution de NaCl 150 mM a été utilisé. Les cellules sont ensuite centrifugées de nouveau et le surnageant est décanté avant la remise en suspension des cellules dans le milieu de formulation,voir l'étape 3.2.
2. La culture d'autres espèces
- Pour adapter le protocole à d'autres espèces bactériennes les procédures de culture et de récolte doivent être modifiées en fonction des besoins de cette espèce. Pour éviter un choc osmotique lors de la manipulation des cellules pendant la récolte et l'étape de lavage (s), l'osmolalité des solutions doit correspondre à celle du milieu de culture à la récolte.
3. Formulation des cellules
- Préparation des solutions de formulation en pesant les composants de la matrice respective et les dissoudre dans de l'eau. Pour obtenir des conditions isotoniques, soit régler la quantité d'excipient ou ajouter de NaCl ou d'un autre soluté compatible cellulaire pour atteindre l'osmolalité désirée. Pour les substances de faible poids moléculaire comme disaccharides les montants peuvent facilement être adaptées pour atteindre les conditions isotoniques. Pour les substances, comme les polymères qui sont de haut poids moléculaire, la tonicité doit être ajusté avec la cellule compatible siluths, par exemple NaCl ou disaccharides. Notez que toute addition d'une substance va influencer les propriétés physiques de la formulation, ce qui peut à son tour influencer le comportement lyophilisation et la survie cellulaire.
- Décanter la solution de lavage (dans ce cas NaCl) et remettre en suspension les cellules dans les milieux de formulation respectifs.
- Assurez-vous que les cellules sont dispersées de manière homogène. Les formulations de faible viscosité sont vortex alors que les formulations des viscosités plus élevées sont mélangés à l'aide en ajoutant, par exemple., Une barre d'agitation et agitant le récipient jusqu'à ce que le mélange homogène est atteint.
- Répartissez les formulations dans des flacons lyophilisateur. Les flacons doivent être pesés vide, avec l'échantillon avant et après lyophilisation pour calculer la quantité d'eau éliminée lors de la lyophilisation.
- Ajouter des bouchons en caoutchouc pour les flacons si les flacons doivent être scellés à l'intérieur du lyophilisateur, voir l'étape 4.3.
- Énumérer les cellules dans chaque formulation avant la lyophilisation, voir l'étape 6. </ Ol>
- Les conditions de lyophilisation doivent être ajustés aux propriétés physiques de la formulation. Le paramètre le plus important est dans ce cas la température de transition vitreuse, Tg, de la formulation, notée Tg 'de l'échantillon de gel-concentré pour indiquer que l'eau est encore présente. Le «Tg de la formulation gel concentré est facilement mesurée par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), voir l'étape 7.
- Ajuster les paramètres du procédé de lyophilisation pour que la température de l'échantillon est toujours en dessous de la Tg de l'échantillon et que la pression de la chambre permet une sublimation rapide de la glace, c'est à dire le séchage primaire, et de l'eau résiduelle dans la formulation, à savoir secondaire séchage. Si la température de l'échantillon est au-dessus de Tg »pendant le processus de séchage il ya un grand risque d'effondrement de la structure de l'échantillon qui peut diminuer de façon significative la survie cellulaire.
- Pour protéger les produits secs après freeze-séchage de l'atmosphère de l'échantillon doit être contrôlée. Si possible, sceller les échantillons dans le lyophilisateur avant le vide est libéré à la fin du cycle de lyophilisation. Alternativement, les flacons peuvent être remplis avec une atmosphère préféré. Il est important d'éviter d'exposer les échantillons à des conditions ambiantes comme l'humidité ou d'oxygène présent dans l'atmosphère de stockage va influencer la survie des cellules.
- Peser les flacons.
- Réhydrater les échantillons avec de l'eau déminéralisée et stérile. La quantité d'eau à ajouter devrait être la même que la quantité prélevée au cours de la lyophilisation et est calculé à partir du poids du flacon vide, le même flacon avec l'échantillon avant et après lyophilisation. Vortex les échantillons de temps en temps alors que les solutions apparaissent homogène.
- Dessinez 100 ul de chaque échantillon et réaliser des dilutions de 10 fois. A partir des dilutions de intereste 100 pi est plaquée sur des plaques de TSA. Les plaques sont incubées à la température et le temps requis.
- Prenez une petite quantité, 5 à 10 mg, de l'échantillon et placez-le dans une casserole DSC-aluminium avec couvercle. Préparer une casserole vide comme référence.
- Réglez le programme de numérisation de température DSC. Le programme de refroidissement est réglé pour reproduire l'étape de congélation dans le programme de lyophilisation. Ceci est fait comme la cinétique de refroidissement peuvent influencer la «Tg des formulations hydratés. Avant la numérisation de chauffage commence faire baisser la température bien en dessous de la Tg attendue »des formulations étudiées, normalement -100 ° C.
- Choisir un taux approprié de chauffage, normalement une vitesse de chauffage de 5 - 40 ° C / min est utilisé. Le signal de flux thermique enregistrée est exprimée en watts, et est influencé par la vitesse de chauffage. Une vitesse de chauffage plus élevée donnera un signal plus importante de Tg '.
- Définissez la plage de température de sorte que it couvre à la fois «Tg et la fonte de la formulation.
- Le dispositif expérimental utilisé dans cette expérience est conforme à la méthode du Noüy pour mesurer la surface.
- Nettoyer la bague de platine et le récipient de mesure soigneusement. Le navire est rincé avec de l'acétone, essuyé avec un chiffon non pelucheux, puis brûlé à l'intérieur avec une flamme incolore. L'anneau devient rouge dans une flamme incolore.
- Remplissez la cuve avec la solution et laissez la surface régler avant la mesure. Pour les solutions où l'état d'équilibre est atteint seulement après une longue période, par exemple des polymères, la configuration simple utilisé ici fourniront des données qualitatives.
- Pour des formulations ayant des viscosités élevées, par exemple des solutions à 2% (p / p) HEC ou l'HPMC, la tension de surface doit être mesurée sur des solutions de concentrations plus faibles, et ensuite extrapolé. Cela peut être fait en profitant du fait quela baisse des niveaux de tension de surface au large à des concentrations inférieures à 0,5% (p / p).
- Prendre une petite quantité de matrice / bactéries et le charger sur un porte-échantillon.
- Monter le porte-échantillon dans le X-ray-diffractomètre.
- Pour analyser n'importe quelle phase cristalline présente dans l'échantillon du progiciel EVA de Bruker peut être utilisé.
- Prendre une petite quantité de Matrix / bactéries sur les flacons et le fixer sur un MEB.
- Chargez le support SEM dans la pulvérisation coucheuse (Thermo Polaron VGScientific SC7640 utilisé dans le présent ouvrage) et le manteau de l'échantillon avec quelques nm de Au / Pd ou Pt. Dans ces expériences, les paramètres de pulvérisation étaient: 1,900 V, 20 mA et 20 sec, pour un ~ 5 - 10 nm de revêtement Au / Pd. L'enrobage permet de réduire la charge électrique au cours de l'acquisition d'image. Il est recommandé de commencer avec un revêtement mince et, si la charge persiste et provoque l'imageartefacts, l'échantillon doivent être enduites de nouveau.
- Chargez le support SEM dans la chambre SEM. Sélectionnez les paramètres d'imagerie appropriées. Pour l'instrument utilisé dans la figure 2 (FEI Strata DB235), nous avons utilisé 5 tension d'accélération de kV, taille de mode 3, sur une distance de travail de 5 mm et le détecteur d'électrons secondaires.
- En option, il est possible d'utiliser le faisceau d'ions focalisé pour couper des sections de la bactérie incorporés dans le polymère de révéler plus de détails.
4. La lyophilisation
5. Réhydratation
6. Enumeration
7. Caractérisation de la formulation de gel Comportement
8. Surface mesures de tension des formulations hydratées
9. L'analyse aux rayons X des formulations sèches
10. Electron Microscopy
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Representative Results
Le tableau 1 présente les données sur la composition de la formulation, des événements enregistrés par DSC thermiques pendant le chauffage des formulations congelées, de la structure des échantillons secs et de la tension superficielle des solutions de formulation. Le T g 'de saccharose a été déterminé à -40 ° C 2, 3 et peut être difficile à détecter pour les concentrations de saccharose inférieure à 20% p / p. L'événement thermique à -35 ° C est probablement liée à l'apparition de glace dissolution 2. La structure cristalline détectée par rayons X dans les échantillons HPMC HEC et aussi vu dans SEM (voir Figure 2b et 2c) se chevauchent avec la forme cristalline normale de NaCl.
La figure 1A montre les données de survie pour le P. Gram négatif putida et le A. Gram-positif chlorophenolicus formulées dans les différentes formulations à base de saccharides. Notez que la tendance dans la façon dont les formulations soutiennent la survie des cellules est le même pour bobactéries ième espèces. Le graphique représenté sur la figure 1B illustre la corrélation entre la survie de lyophilisation et les tensions superficielles des formulations.
La figure 2 montre SEM-images des formulations sèches. Pour les quatre polymères présentés ici, la matrice formée a l'apparence d'"papier croustillant": feuilles lisses interconnectés dans lequel les bactéries sont intégrés et se présentent comme des ondulations. Pour Ficoll et saccharose, les feuilles sont environ 1 um d'épaisseur et de 10 à 20 m de large, avec Ficoll ayant une surface lisse. HPMC et HEC former des feuilles très minces, peut-être en raison du fait que la quantité de polymère est inférieure à ces formulations à base de cellulose que dans les autres (tableau 1). De plus, les cristaux de sel ont été observés pour HEC et HPMC, ce dernier présentant une plus grande quantité de précipités sur la surface des feuilles de polymère. Les bactéries sont plus facilement visibles dans les formulations à base de cellulose, car les feuilles sont eintérieure. En saccharose et Ficoll, ils sont surtout observés en ondulation des surfaces lisses autrement.
| composition de la formulation | Événements thermiques détectées dans les préparations congelées | Structure de formulation sèche | La tension de surface des formulations non séchées (mN m -1) |
| 10% de saccharose | début de la dissolution de la glace, de -35 ° C | saccharose amorphe | 72 ± 0,1 |
| 10% de Ficoll, NaCl 150 mM | Tg ', -22 ° C | Ficoll amorphe | 68 ± 0,3 |
| 2% de HEC, 150 mM de NaCl | fusion eutectique de glace et de NaCl, -28 ° C | amorphe HEC, cristallin NaCl | 64 ± 0,6 |
| 2% de HPMC, 150 mM de NaCl | fusion eutectique de la glace et du NaCl, -27 ° C | 52 ± 0,8 |
Tableau 1. La composition des différentes formulations et les propriétés des formulations aqueuses ou sèches. Les concentrations de polymères de l'École des HEC et HPMC ont été maximisé pour atteindre une couverture de matrice assez épaisse des bactéries mais qui ont encore une solution viable en ce qui concerne la viscosité.
Figure 1. A) Les taux de survie des lyophilisée P. putida (blanc) et A. chlorophenolicus (gris) lorsqu'il est formulé dans des solutions sur la base du saccharose disaccharide ou les polymères de Ficoll, HEC et HPMC, B) Corrélation entre la survie des cellules après la lyophilisation et la tension superficielle des formulations non séchées.
Figure 2. Images MEB de P. putida en quatre formulations différentes: a) de saccharose, b) Ficoll, c) HEC, d) HPMC. Les bactéries sont difficiles à voir en a) et b) parce que la feuille de polymère sont assez épais et peut envelopper les bactéries complètement, en c) et d) les bactéries présentent une place plus importante sur la surface. En d), ils peuvent être distingués de la grande quantité de sel précipite en raison de leur forme et de contraste, tels qu'ils apparaissent comme oblongues, globules sombres.
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Discussion
Le motif de cette étude était d'étudier certaines propriétés de formulation qui peuvent être d'importance pour la survie des cellules pendant la lyophilisation. Bien que la tolérance intrinsèque de séchage varie selon les espèces, comme illustré à la figure 1A, la tendance de la façon dont les formulations différentes soutien survie cellulaire est similaire. Il est instructif de commencer par une comparaison de saccharose et de Ficoll. On croit qu'un facteur clé pour une formulation à soutenir la survie des cellules est la capacité de l'ingrédient de la formulation (s) pour remplacer l'eau lors de la déshydratation, maintenant ainsi la structure des protéines et les membranes de la cellule également à l'état sec. Disaccharides tels que le saccharose, le tréhalose aussi montrer cette propriété, alors que les polymères tels que l'amidon de polysaccharide font pas 5,11. Les polymères sont considérés comme trop volumineux pour interagir avec les lipides de la membrane de la même façon que les disaccharides. Une autre propriété importante pour la réussite de lyophilisationtion des micro-organismes est la capacité de la matrice de support pour vitrifier (c.. devenus solides amorphes) lors de la lyophilisation. La structure amorphe est bénéfique pour la protection et le maintien des cellules séparées. Fait intéressant, les deux disaccharides et les polymères vitrifient facilement si la lyophilisation est correctement effectuée. Nos résultats montrent que tant le saccharose et formulations à base de Ficoll devenir amorphe après lyophilisation, voir le tableau 1 et le soutien survie des cellules aussi bien. Cependant, il ya des différences significatives entre les deux saccharides. Contrairement à la saccharose, la molécule est de Ficoll, avec un poids moléculaire de 400 kDa, trop grand pour remplacer l'eau dans les interactions avec la membrane lipidique au cours de lyophilisation 4, 5. En outre, comme les molécules Ficoll sont exclus de l'espace périplasmique des bactéries à Gram négatif, à nouveau en raison de leur taille 6, l'absorption cellulaire de Ficoll est peu probable. Sur cette base, nous suggérons que l'effet protecteur dispoded par la formulation en saccharose n'est pas d'abord en raison de l'absorption cellulaire du disaccharide, important pour la capacité de l'eau de remplacement de structures intracellulaires 7, 8. Au contraire, la capacité de Ficoll pour soutenir la survie des cellules a à faire avec des propriétés communes à la fois le Ficoll et la formulation de saccharose, par exemple, la structure amorphe.
En se concentrant sur les polymères, il est évident à partir de la figure 1A que la capacité des formulations de polymères pour soutenir la survie des cellules varie. L'analyse aux rayons X a montré que NaCl cristallisé au cours de la lyophilisation et coexiste avec la structure autrement amorphe des formulations HEC et HPMC. Aucune matière cristalline a été détectée dans la formulation à base de Ficoll. NaCl peut former des complexes avec les groupements hydroxyles en glucides 9, 10. Dans les formulations de Ficoll et HEC à base de NaCl à la proportion molaire de groupement hydroxyle est 1h11 et 01h01, respectivement, ce qui explique pourquoi aucune cristallisation a été détectéedans la formulation Ficoll basée. La séparation de phase entre NaCl et les polymères de cellulose a également été observée dans le DSC-enquêtes. Une fusion eutectique a été enregistrée au cours du chauffage de la HEC congelé et HPMC-formulations indiquant que la séparation de phase a lieu à l'état congelé. La morphologie et la microstructure de la formulation est révélé par imagerie MEB (Figure 2) et corrobore les données de rayons X et DSC. Les cellules bactériennes sont vus dépassant des feuilles avec déposées cristaux de NaCl clairement visibles sur la surface des HEC-feuilles. Sur la base de la similitude entre les taux de survie des bactéries formulées dans les solutions HEC-solution et Ficoll par rapport à hpmc nous concluons que l'état de sel, que ce soit dispersée sous forme de cristaux ou dissous dans le polymère, n'est pas en corrélation avec la survie cellulaire. Au lieu de la survie des cellules présente une relation avec la tension de surface de la formulation, voir la figure 1B. Pour les tensions de surface inférieures, lLes taux de survie eurs sont enregistrées pour les bactéries. On notera cependant que la tension de surface mesurée affiche l'interaction entre les solutés, soit du saccharose et les polymères et les molécules de solvant. Néanmoins, il permet une spéculation indirecte que l'activité de surface de polymères peut être liée à leur tendance à interagir aussi avec la surface des cellules de manière déstabilisante. Comme la concentration des solutés augmente lors de la congélation, les effets négatifs peuvent être potentialisés expliquer pourquoi l'effet négatif des polymères tensioactifs n'ont pas vu quand seulement stocker les bactéries présentes dans les formulations hydratantes entièrement.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu par la Fondation suédoise pour la recherche stratégique environnementale (Mistra) à travers le programme DOM et Grant 211684 (BACSIN) du programme-cadre de l'Union européenne Communauté 7e PC. Nous remercions J. Engstrand de l'aide pour filmer l'analyse aux rayons X et L. Tang pour aider avec le récit conceptuel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
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