Summary
Dondurma-kurutma genellikle canlı bakteri hücrelerinin kuru ürün elde etmek kolay ve kullanışlı bir yoludur. Sürecin bir sorun hücre hayatta kalabilmek. Burada ayrıntılı dondurarak kurutma esnasında hücre hayatta kullanılan formülasyonunun özelliklerini nasıl etkilediğini araştırmak için bir işlem.
Abstract
Hücresel su geri dönüşümlü depolama kolaylaştırmak için mikroorganizmaların inaktive kaldırılabilir. Kaldırma Böyle bir yöntem, hafif bir dehidrasyon yöntemi olarak kabul edilir dondurarak kurutma vardır. Kurutma esnasında hücrenin hayatta kalması kolaylaştırmak için, hücreler, genellikle daha önce formüle edilmektedir. Formülasyon hücreleri katıştırır ve dondurma ve kurutma sırasında hücrelerin üzerine uygulanan çeşitli zararlı stresleri koruyan bir matris oluşturur. Burada ve dondurularak kurutulduktan sonra hücrelerin hayatta kalma oranını değerlendirmek için genel bir yöntem sunmak ve dört farklı formülasyonları ile elde edilen sonuçların karşılaştırılması ile de gösterilmiştir: disakarid sukroz, polimer Ficoll PM400 elde sakaroz ve ilgili polisakkaritler, hidroksietil selüloz (HEC iki bakteri suşları, P.) ve hidroksipropil metil selüloz (HPMC), putida KT2440 ve A. chlorophenolicus A6. Bu çalışmada biz dondurarak kurutma için formülasyonları hazırlamak için nasıl ve mekanik araştırmak için nasıl göstermekdiferansiyel taramalı kalorimetre (DSC), yüzey gerilimi ölçümleri, X-ışını analizi ve elektron mikroskobu kullanarak ve sağkalım oranları için bu verileri ilgili formülasyonu karakterize tarafından rehidrasyon sonra hücre canlılığı izm. Polimerler, değişen derecelerde ilgili polisakarit benzeyen sukroz, monomer cinsi bir yapı elde etmek için seçilmiştir. Bu yöntemi kurulum kullanarak biz formülasyonun bazı fiziksel özellikleri 1 kontrol eğer polimerler disakkaritler kadar etkili hücre sağkalım destekleyebilir gösterdi.
Protocol
1. P. yetiştirme ve hasat putida
- P. bir koloni ile triptik soy broth 100 ml (TSB) aşılayarak Pseudomonas putida bir starter kültür hazırlayın putida hücreleri triptik soya suyu (TSA) ile desteklenmiş agar üzerinde kültürlenmiştir. 130 rpm ayarlanmış bir sallayarak gemide 30 ° C de kültür tutun.
- 7 saat taze TSB ortamı için marş kültür eşdeğer ana kültürün son hacminin 1/10 ile bir kısım aktardıktan sonra. 16 saat 130 rpm'de sallayarak gemide 30 ° C hücreleri tutun.
- Büyüme 16 saat sonra hücreler, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1500 x g'de hücre kültürü iplik ile hasat edilir. Süpernatant süzün ve pellet besiyerine izotonik olan bir NaCl çözeltisi içinde olan hücre yeniden süspanse ederek hücreleri yıkayın. Bu durumda, 150 mM NaCI çözeltisi kullanıldı. , Hücreler daha sonra bir kez daha santrifüje tabi tutulur ve yüzer madde formülasyonu ortam içinde yeniden süspansiyona önce dekante ediliradım 3.2.
2. Diğer türlerin ekimi
- Diğer bakteri türleri için protokol uyarlamak için yetiştirme ve hasat işlemleri bu türlerin ihtiyaçlarına göre değiştirilmelidir. Hasat ve yıkama adım (lar) ve hücreleri işlerken ozmotik şok önlemek için, çözümlerin ozmolalite hasatta büyüme ortamı uyumlu olması gerekmektedir.
3. Hücre Formülasyon
- Ilgili matris bileşenleri tartılarak formülasyonu çözümleri hazırlayın ve onları suda çözülür. Izotonik koşulları elde etmek için, ya yardımcı maddenin miktarını ayarlamak veya istediğiniz ozmolalite ulaşmak için NaCl veya başka bir hücre uyumlu çözünen ekleyin. Gibi disakaridler gibi düşük molekül ağırlıklı maddeler için miktarlarda kolayca izotonik koşullarına ulaşmak için ayarlanabilir. Yüksek moleküler ağırlığa sahip olan polimer gibi maddeler için, tonisite çok uyumlu hücre ile ayarlanmalıdırLutes, örneğin NaCl veya disakkaritler. Bir maddenin bir yanı da dondurma-kurutma davranışları ve hücre canlılığı etkileyebilir, formülasyonun fiziksel özelliklerine, etkileyecektir unutmayın.
- Yıkama solüsyonu (bu durumda, NaCl) boşaltacaktır ve ilgili formülasyon dahil edilmesi, hücrelerin yeniden askıya.
- Hücrelerin homojen bir şekilde disperse edilir olduğundan emin olun. Daha yüksek viskoziteler formülasyonlar kullanılarak karıştırılmış ise düşük viskoziteli formülasyonlar, örn., Bir karıştırma çubuğu eklenmesi ve homojen karışım elde edilene kadar kabı çalkalayarak vortekslenmiş.
- Dondurarak kurutma şişeleri içine formülasyonlar bölün. Şişeleri önce ve dondurma-kurutma sırasında çıkarılan su miktarını hesaplamak için dondurularak kurutulduktan sonra numune ile, boş bir seçim yapılması gerekmektedir.
- Şişeleri dondurma-kurutma makinesi içinde imzalanacak istiyorsak şişeleri için lastik tapalar ekle, 4.3 adıma bakın.
- Dondurarak kurutmadan önce, her bir oluşum içinde hücrelerin Numaralandırma, adım 6 bkz. </ Ol>
- Dondurarak kurutma koşulları, formülasyonun fiziksel özelliklerine göre ayarlanması gerekir. En önemli parametre, bu durumda, cam geçiş ısısı Tg, formülasyon, bu su hala mevcut olduğunu belirtmek için donma-konsantre numune için Tg 'anlamına gelir. Dondurarak konsantre formülasyonun Tg 'kolayca diferansiyel tarama kalorimetresi (DSC) ile ölçülür, adım 7 bkz.
- Dondurarak kurutma işleminin parametrelerini ayarlama dolayısı ile de numunenin sıcaklığı, numunenin Tg altında ve bu her zaman olduğu oda basıncı, yani sekonder, formülasyon içinde bir buz hızlı süblimasyon, yani birincil kurutma ve artık su sağlar kurutulması. Numune sıcaklığı kurutma işlemi sırasında 'Tg üzerindeki ise önemli hücresel yaşam azaltabilir numunenin Parçalanmaya büyük bir risk vardır.
- F sonra kuru ürünlerini korumak içinreeze kurutma örnek atmosfer kontrol edilmesi gerekir. Mümkünse vakum dondurarak kurutma döngüsünün sonunda serbest bırakılmadan önce, dondurularak-kurutma örnekleri mühür. Seçenek olarak ise, tercih edilen şişe, atmosfer ile doldurulabilir. Bu depolama atmosferdeki nem ve oksijen mevcut olduğu gibi ortam koşullarına örnekleri maruz kalmasını önlemek için önemli olan hücrelerin hayatta kalma etkileyecektir.
- Şişeleri tartılır.
- Iyonu giderilmiş ve steril su ile örnekleri rehidrate. Ilave edilecek su miktarı, dondurarak kurutma sırasında çıkarılan ve boş bir flakon, dondurarak kurutma öncesi ve sonrası örnek ile aynı flakonun ağırlığı hesaplanır miktarı olarak aynı olmalıdır. Vortex örnekleri şimdi ve sonra tekrar çözümler homojen görünür kadar.
- Her bir örnekten 100 ul çizmek ve 10-kat seri dilüsyonları olun. Inte dilüsyonları itibarengeri kalan 100 ul TSA-plakalar üzerinde kaplıdır. Plakalar gerekli olan sıcaklık ve süre inkübe edilir.
- Küçük bir miktar, Take 5 - 10 mg, örnek ve kapaklı bir DSC-alüminyum tava içine alın. Bir referans olarak boş bir tava hazırlayın.
- DSC sıcaklık tarama programı ayarlayın. Soğutma programı dondurarak kurutma programına dondurma basamağı taklit etmek için ayarlanır. Soğutma kinetik sulu formülasyonların Tg 'etkileyebilir olarak bu yapılır. Isıtma tarama de normal olarak incelenmiştir formülasyonların beklenen Tg ', -100 ° C'nin altında bir sıcaklıkta, çökertmek başlamadan önce
- 40 ° C / dak kullanılır - uygun bir ısıtma hızında, 5 normal olarak bir ısıtma hızı seç. Kaydedilen ısı akışı sinyal watt olarak ifade edilir ve ısıtma hızı etkilenir. Daha yüksek ısıtma hızı Tg 'daha büyük bir sinyal verecektir.
- Sıcaklık aralığı ayarlayın, böylece it Tg 've formülasyonun erime kapsar.
- Bu deneyde kullanılan deney düzeneği yüzey ölçmek için du Nouy yöntemine göre.
- Dikkatlice platin halkası ve ölçüm kabı temizleyin. Geminin, aseton ile durulanır tüy bırakmayan bir doku ile sildi ve daha sonra renksiz bir alev ile iç yakılır. Halka renksiz bir alev kırmızı renkte yanar.
- Çözüm ile gemi doldurun ve yüzey ölçmeden önce yerleşmek izin. Denge durumu sadece uzun bir süre sonra ulaşıldığında çözümler için, örneğin polimerler, burada kullanılan basit kurulum nitel veriler sağlayacaktır.
- Yüksek viskoziteli,% 2 arasında örneğin, çözeltiler (w / w) olan formülasyonlar için HEC veya HPMC, yüzey gerilimi daha düşük konsantrasyonlarda çözümlerine ölçülmelidir çıkılarak ve daha sonra. Bu gerçeği yararlanarak yapılabilir ki% 0.5 altındaki konsantrasyonlarda (a / a) de yüzey gerilimi seviyeleri kapalı düşüş.
- Matris / bakteri az miktarda alın ve bir numune tutucu üzerine yük.
- X-ray difraktometresi içine numune tutucu monte edin.
- Örnek herhangi bir kristal faz analiz etmek üzere Bruker ikinci EVA program paketi kullanılabilir.
- Şişeleri matris / bakteri küçük bir miktar dışarı atın ve bir SEM saplama üzerine sabitleyin.
- Sıçramasına-lak (Bu çalışmada kullanılan Thermo VGScientific Polaron SC7640) ve Au / Pd veya Pt birkaç nm ile kat örnek SEM tutucu yükleyin. Bu deneylerde püskürtme parametreler: Bir ~ 5 için 1.900 V, 20 mA ve 20 sn, - 10 nm Au / Pd kaplama. Kaplama görüntü alımı sırasında elektrik şarj azaltır. Şarj devam ve görüntü neden ise, ince bir kaplama ile başlamak önerilir veeşya, numune tekrar kaplanmalıdır.
- SEM odasında SEM tutucu yükleyin. Uygun görüntüleme parametreleri seçin. Şekil 2 (FEI Strata DB235) kullanılan alet için biz 5 kV hızlandırma gerilimi, spotsize 3, 5 mm ve ikincil elektron dedektörü bir çalışma mesafesi kullanılır.
- İsteğe bağlı olarak, daha fazla ayrıntıları ortaya çıkarmak için, polimer içinde gömülü bakteri çapraz kesitleri için odaklanmış iyon yaygı kullanmak mümkündür.
4. Dondurma-kurutma
5. Rehidrasyon
6. Sayım
7. Donma Davranış formülasyonu karakterizasyonu
8. Sulu Formülasyonlarının Yüzey Gerilimi Ölçümleri
9. Kuru formülasyonlar arasından X-ray Analizi
10. Elektron Mikroskobu
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1, formülasyon bileşimi verileri, dondurulmuş formülasyonları, kuru numune yapısını ve formülasyonun çözümler yüzey gerilimi ısıtma esnasında DSC tarafından kaydedilen ve termal olay gösterir. Sakaroz T g '-40 ° C de 2, 3 ile tespit edilmiştir ve% 20 ağ / ağ aşağıdaki sukroz konsantrasyonu tespit etmek için zor olabilir. -35 ° C termal olay muhtemelen buz 2 çözünme başlangıcı ile ilgilidir. Kristal yapısı HEC ve HPMC örneklerde X-ışını tarafından tespit edilir ve de (Şekil 2b ve 2c bakınız) SEM görülen NaCl normal kristal formu ile örtüşmektedir.
Şekil 1A Gram-negatif P. için hayatta kalma verileri gösterir putida ve Gram-pozitif A. chlorophenolicus farklı sakarit bazlı formülasyonlar halinde formüle edilmiştir. Formülasyonlar hücre yaşam destek ne kadar iyi eğilim şişeler için aynı olduğuna dikkatinci bakteri türleri. Şekil 1B 'de gösterilen arsa dondurarak kurutma hayatta kalma ve formülasyonların yüzey gerilimi arasındaki bir korelasyon göstermektedir.
Şekil 2, kuru formülasyonlar SEM görüntüleri gösterir. Burada gösterilen dört polimerler için, oluşan matris "gevrek kağıt" bir görünüme sahip: bakteri gömülü ve oluk gibi göstermek vardır birbirine düzgün yaprak hangi. Ficoll ve Sakkaroz için, sayfaları yaklaşık 1 mikron kalınlığında ve 10 - 20 mikron genişliğinde, Ficoll daha yumuşak bir yüzeye sahip. HPMC, HEC ve polimer miktarının diğerleri (Tablo 1) göre, bu selüloz bazlı formülasyonlar daha az olması nedeniyle muhtemelen çok ince levha, oluşturur. Ayrıca, tuz kristalleri polimer levhalar yüzeyinde çökelir daha büyük bir miktarını gösteren ikincisi ile, HEC ve HPMC gözlenmiştir. Yaprak th vardır, çünkü bakteriyel daha kolay selüloz bazlı formülasyonlar görülüriç. Sukroz ve Ficoll, onlar çoğunlukla aksi düz yüzeylerin Oluklu olarak görülmektedir.
| Formülasyon kompozisyon | Termal olaylar dondurulmuş formülasyonlar içinde tespit | Kuru formülasyon Yapısı | Kurutulmamış formülasyonların Yüzey gerilimi (mN m -1) |
| % 10 Sükroz | buz çözülme başlangıcı, -35 ° C | amorf sakaroz | 72 ± 0.1 |
| 10% Ficoll 150 mM NaCI | T g ', -22 ° C | amorf Ficoll | 68 ± 0.3 |
| % 2 HEC, 150 mM NaCI | buz ve NaCl ötektik erime, -28 ° C | amorf YÖK, kristal NaCl | 64 ± 0.6 |
| % 2 HPMC, 150 mM NaCI | buz ve NaCl ötektik erime, -27 ° C | 52 ± 0.8 |
Tablo 1. Sulu veya kuru formülasyonlar, farklı formülasyonlar ve özelliklerinin bir bileşim. HEC ve HPMC polimer konsantrasyonu bakteri, yeterince kalın bir matris elde etmek için kapak maksimize ama yine viskozite ile ilgili olarak çalışabilir bir çözüm olduğu bulunmuştur.
Şekil 1. Dondurma bir) sağkalım oranları P. kurutulmuş putida (beyaz) ve A. disakarid sukroz ya da polimerler dondurarak kurutmadan sonra hücre canlılığı ve BM-kurutulmuş formülasyonlar arasında yüzey gerilimi arasındaki Ficoll, HEC ve HPMC, B) Korelasyon dayalı çözüm olarak formüle chlorophenolicus (gri).
FŞEKIL 2. P. SEM görüntüleri Dört farklı formülasyonlar içinde putida: a) sakaroz, b), Ficoll C) HEC, d) HPMC. Polimer tabakasının oldukça kalın ve tamamen saran bakteri olabilir, çünkü bakteri) bir görmek zordur) ve b, c) ve d) bakterilerin yüzeyinde daha belirgin olarak gösterilir. D), onlar tuz büyük miktarda ayırt edilebilir onlar gibi dikdörtgen, koyu cisimcikleri göründükleri gibi, çünkü onların şekil ve kontrast çökeltileri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma için itici dondurarak kurutma sırasında hücre hayatta kalmak için önemli olabilecek bazı formülasyon özellikleri araştırmaktır. Içsel kurutma tolerans farklı türler arasında farklılıklar göstermekle beraber, Şekil 1A, farklı formülasyonları destek hücre sağkalım benzer ne kadar iyi eğilim gösterildiği. Bu sakaroz ve Ficoll bir karşılaştırma ile başlamak bilgilendirici. Bu hücre hayatta kalma desteklemek için bir formülasyon için önemli bir faktördür ve böylece de kuru durumda hücrenin protein ve membran yapısını koruyarak, kurutma sırasında suyun yerini almak üzere formülasyon bileşen (ler) arasında yeteneği olduğuna inanılmaktadır. Bu tür polimerler, polisakarit nişasta gibi 5,11 yok ise sukroz gibi disakaritler değil, aynı zamanda, bu özellik göstermektedir trehaloz. Polimerler disakaridler ile aynı şekilde, membran lipidleri ile etkileşim için çok büyük olarak kabul edilir. Başarılı bir dondurma-kurutma için önemli bir başka özelliğiMikroorganizmaların ING dondurarak kurutma sırasında (örneğin,. haline amorf katı madde) cam haline getirmek üzere destek matrisi yeteneğidir. Amorf yapısı ayrılmış hücreleri koruyucu ve tutmak için faydalıdır. Dondurarak kurutma uygun olarak gerçekleştirilir İlginçtir ki, disakaritler ve polimerlerin her ikisi de kolayca camlaştırma. Elde ettiğimiz sonuçlar, sukroz ve Ficoll bazlı formülasyonlar hem dondurularak kurutulduktan sonra amorf olduğunu göstermeye, eşit derecede iyi Tablo 1 ve destek hücre yaşamını bkz. Ancak, iki sakkaritler arasında önemli farklılıklar vardır. Sukroz aksine, Ficoll molekülü, 400 kDa'lık bir moleküler ağırlığa sahip, 4, 5, dondurarak kurutma sırasında lipid membranlar ile etkileşim içinde su yerine çok büyüktür. Ayrıca, Ficoll moleküller olarak büyüklük 6 nedeniyle, yine Gram negatif bakteriler ve periplazmik boşluğun engellendiğinde, Ficoll hücresel alımı mümkün değildir. Buna göre, biz öneririz koruyucu etkisi yazarlarasakaroz formülasyon tarafından ded hücre içi yapılar 7, 8 su yerine kapasitesi önemli, disakarid hücresel alımını öncelikle bağlı değildir. Aksine, hücrenin hayatta kalması desteklemek için Ficoll yeteneği, Ficoll ve sükroz formülasyon, her ikisi için ortak olan özellikleri ile amorf bir yapıya, örneğin sahiptir.
Polimerler odaklanarak, hücrenin hayatta kalması desteklemek için polimer formülasyonlarının özelliği değişir Şekil 1A bellidir. X-ışını analizleri NaCI dondurarak kurutma esnasında kristalize edilmiş ve HEC ve HPMC formülasyonlar başka amorf bir yapıya sahip bir arada olduğunu göstermiştir. Resim kristalli materyal Ficoll bazlı formülasyon içinde tespit edildi. NaCl karbonhidrat 9, 10 içinde yer alan hidroksil grupları ile kompleksleri oluşturur. Hidroksil yarısının mol oranı Ficoll ve HEC bazlı formülasyonlar içinde NaCI kristalizasyon yok tespit edildi neden açıklayan, sırasıyla, 1:11 ve 1:1 olduFicoll-bazlı formülasyon. NaCl ve selüloz polimerler arasındaki faz ayrılması da DSC-araştırmalar gözlenmiştir. Bir ötektik erime faz ayrımı donmuş halde yer alır belirten dondurulmuş HEC ve HPMC-formülasyonların ısıtma sırasında kaydedilmiştir. Formülasyonun morfolojisi ve mikro SEM görüntü (Şekil 2) tarafından bildirilen ve DSC ile X-ışını verileri doğrular edilir. Bakteri hücreleri, HEC levhalarının yüzeyi üzerinde açıkça görülebilir NaCl kristaller tortulaştı ile yaprak çıkıntılı görülür. Biz kristaller olarak dağılmış veya polimer çözünmüş olsun tuzun devlet, hücre sağkalım ile ilişkili değildir sonucuna HPMC göre YÖK-çözüm ve Ficoll çözümleri formüle bakteriler için sağkalım oranları arasındaki benzerlik göre. , Hücrenin hayatta kalma formülasyonların yüzey gerilimine sahip bir ilişki olduğunu göstermektedir, Şekil 1B. Daha düşük yüzey gerilimleri için l,ower sağkalım oranları bakteriler için kaydedilir. Ölçülen yüzey gerilimi çözücüler, örneğin, sakroz ve polimer, ve çözücü molekül arasındaki etkileşimi gösterir unutulmamalıdır. Yine de polimerlerin yüzey aktivitesi denge bozucu bir şekilde hücre yüzeyleri ile de etkileşim eğilimleri ile ilgili olabilir dolaylı bir spekülasyon sağlar. Çözünen konsantrasyonu donma sırasında arttıkça, olumsuz etkileri yüzey aktif polimerlerin olumsuz etkisi görülmedi neden açıklayan potansiyelize olabilir zaman tam olarak nemlendirici formüller sadece depolama bakteri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Çalışma DOM programı ve Avrupa Birliği Topluluk FP7 Çerçeve programından hibe 211.684 (BACSIN) ile Stratejik Çevre Araştırma için İsveç Vakfı (mistra) tarafından desteklenmiştir. Biz kavramsal anlatım ile yardımcı olmak için X-ışını analizi ve L. Tang filme yardım için J. Engstrand teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll PM 400 | GE-healthcare | 17-0300-10 | |
| HEC (Natrosol-M Pharm Grade) | Ashland | Gift from Ashland | |
| HPMC (Methocel F4M) | Dow | Gift from the Department of Pharmacy, Uppsala University | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S2395 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| Tryptic Soy broth | Merck | 105459 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck | 105458 | |
| Lyostar II | FTS Kinetics | N.A. | |
| Pyris Diamond DSC | Perkin-Elmer | N.A. | |
| Bruker AXS SMART CCD 1k Diffractometer | Bruker | N.A | |
| Dual-beam FEI Strata DB235 FIB/SEM | FEI | N.A | |
| Krüss Educational Tensiometer | Krüss | N.A. |
References
- Wessman, P., Mahlin, D., et al. Impact of matrix properties on the survival of freeze-dried bacteria. J. Sci. Food Agric. 91 (14), 2518-2528 (2011).
- Ablett, S., Izzard, M. J., et al. Differential Scanning Calorimetric Study of Frozen Sucrose and Glycerol Solutions. Journal of the Chemical Society-Faraday Transactions. 88 (6), 789-794 (1992).
- Knopp, S. A., Chongprasert, S., et al. The relationship between type TMDSC curve of frozen sucrose solutions and collapse during freeze-drying. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 54 (2), 659-672 (1998).
- Crowe, J. H., Leslie, S. B., et al. Is Vitrification Sufficient to Preserve Liposomes during Freeze-Drying. Cryobiology. 31 (4), 355-366 (1994).
- Jain, P., Sen, S., et al. Effect of glass-forming biopreservatives on head group rotational dynamics in freeze-dried phospholipid bilayers: A P-31 NMR study. Journal of Chemical Physics. 131 (2), (2009).
- Stock, J. B., Rauch, B., et al. Periplasmic Space in Salmonella-Typhimurium and Escherichia-Coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (21), 7850-7861 (1977).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., et al.
- Leslie, S. B., Israeli, E., et al. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Applied and Environmental Microbiology. 61 (10), 3592-3597 (1995).
- Nesarikar, V. V., Nassar, M. N. Effect of cations and anions on glass transition temperatures in excipient solutions. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (3), 259-264 (2007).
- You, Y., Ludescher, R. D. The effect of sodium chloride on molecular mobility in amorphous sucrose detected by phosphorescence from the triplet probe erythrosin B. Carbohydr. Res. 343 (2), 350-363 (2008).
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Nguyen, K. H. N., Crowe, L. M. Is vitrification involved in depression of the phase transition temperature in dry phospholipids. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1280, 187-196 (1996).
