Si descrive un protocollo per tempo reale videoimaging della migrazione neuronale nel proencefalo mouse. La migrazione di viralmente-etichettati o innestate precursori neuronali è stata registrata in fettine acute vivo utilizzando ampio campo dell'imaging fluorescente con un intervallo di acquisizione relativamente rapido per studiare le diverse fasi di migrazione cellulare, comprese le durate delle fasi stazionaria e migrazione e la velocità di migrazione.
Vi è un sostanziale corpo di prove che indicano che i nuovi neuroni funzionali sono costitutivamente generati da un pool endogeno delle cellule staminali neurali nelle aree riservate del cervello dei mammiferi adulti. Neuroblasti Newborn dalla zona subventricolare (SVZ) migrano lungo il torrente migratorio rostrale (RMS) per la loro destinazione finale nel bulbo olfattivo (OB) 1. Nel RMS, neuroblasti migrano tangenzialmente in catene ensheathed da processi astrocitari 2,3 utilizzando vasi sanguigni come supporto strutturale e una fonte di fattori molecolari richiesti per la migrazione 4,5. Nel OB, neuroblasti staccare dalle catene e migrano radialmente negli strati differenti bulbari dove si differenziano in interneuroni e integrare nella rete esistente 1, 6.
In questo manoscritto si descrive la procedura per la migrazione delle cellule di controllo in fettine acute del cervello dei roditori. L'uso di sezioni acute permette assessmento di migrazione cellulare nel microambiente che somiglianti a condizioni in vivo e nelle regioni del cervello che sono di difficile accesso per l'imaging in vivo. Inoltre, evita condizione lunga coltura come nel caso di colture organotipiche e cellule che possono eventualmente alterano le proprietà di migrazione delle cellule. Precursori neuronali in fettine acute possono essere visualizzate utilizzando ottiche DIC o proteine fluorescenti. Etichettatura virale dei precursori neuronali nel SVZ, innesto neuroblasti da topi reporter nella SVZ di topi wild-type, e l'utilizzo di topi transgenici che esprimono la proteina fluorescente in neuroblasti sono tutti i metodi adatti per la visualizzazione neuroblasti e dopo la loro migrazione. Il metodo seguito, tuttavia, non consente di singole celle essere monitorati per lunghi periodi di tempo a causa della elevata densità di cellule marcate. Abbiamo utilizzato un ampio campo di microscopio fluorescente verticale dotato di una fotocamera CCD per ottenere un intervallo di acquisizione relativamente rapido (uno image ogni 15 o 30 secondi) per identificare in maniera affidabile la fase stazionaria e migratori. Una identificazione precisa della durata delle fasi stazionarie e migratorio è cruciale per l'interpretazione univoca dei risultati. Abbiamo anche eseguito più z-step acquisizioni per monitorare la migrazione neuroblasti in 3D. Ampio campo di imaging a fluorescenza è stato ampiamente utilizzato per visualizzare migrazione neuronale 7-10. Qui, descriviamo protocollo dettagliato per l'etichettatura di neuroblasti, l'esecuzione in tempo reale di video-imaging della migrazione neuroblasti in fettine acute del proencefalo topo adulto, e analizzare la migrazione cellulare. Mentre il protocollo descritto esemplificato la migrazione dei neuroblasti del RMS adulto, può anche essere utilizzata per seguire la migrazione cellulare nel cervello embrionale e postnatale precoce.
La mirati corretta dei precursori neuronali alle regioni cerebrali appropriate è un processo fondamentale alla base il corretto montaggio e la funzione dei circuiti neurali. La grande maggioranza delle cellule migrano durante lo sviluppo embrionale e nel cervello postnatale solo in alcune regioni, come la OB, giro dentato e cervelletto, spostamento neuronale avviene ancora. I meccanismi orchestrando la migrazione delle cellule nel cervello postnatale rimangono, tuttavia, poco conosciuto. La conoscenza dei meccanismi e …
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da un Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR) concede ASJK è stato in parte sostenuto da una borsa di studio Université Laval. AS è il destinatario di un Canada Research Chair in neurogenesi postnatale.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |