Summary
אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.
Abstract
יש גוף משמעותי של ראיות מצביעות על כך שתאי עצב חדשים נוצרים באופן פונקציונלי constitutively מברכת אנדוגני בתאי גזע עצביים באזורים מוגבלים של המוח של יונקי הבוגרים. neuroblasts יילוד מאזור subventricular (SVZ) נודד לאורך הנחל הנודד המקורי (RMS) ליעד הסופי שלהם בנורת חוש הריח (OB) 1. בRMS, neuroblasts להעביר באופן כלשהו ברשתות ensheathed ידי תהליכי astrocytic 2,3 באמצעות כלי דם כתמיכה מבנית ומקור לגורמים מולקולריים הנדרשים להגירת 4,5. בOB, neuroblasts להתנתק מהכבלים ולהעביר רדיאלית לשכבות השונות המוח המאורך שבו הם להתמיין לinterneurons ולהשתלב ברשת הקיימת 1, 6.
בכתב יד זה יתאר את ההליך לנדידת תאי ניטור בפרוסות חריפות של המוח המכרסם. השימוש בפרוסות חריפות מאפשר assessmאף אוזן גרון של נדידת תאים בmicroenvironment שדומה מאוד לתנאי vivo ובאזורים במוח שקשה לגשת לדימות vivo. בנוסף, זה ימנע מצב culturing ארוך כמו במקרה של תרבויות organotypic ותא שסופו של דבר עשוי לשנות את מאפייני הנדידה של התאים. מבשרי נוירונים בפרוסות חריפות ניתן דמיינו באמצעות אופטיקה DIC או חלבוני ניאון. תיוג הנגיפי של מבשרי נוירונים בSVZ, השתלת neuroblasts מעכברי כתב לתוך SVZ של עכברי סוג פראי, ושימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בneuroblasts כל השיטות המתאימות להמחשת neuroblasts ולאחר הגירתם. שיטה האחרת, לעומת זאת, אינה מאפשרת לתאים בודדים להיות במעקב במשך תקופות זמן ארוכים, בגלל הצפיפות הגבוהה של תאים שכותרתו. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ זקוף ניאון שדה רחב מצויד במצלמת CCD להשיג מרווח רכישה מהירה יחסית (1 image כל 15 או 30 שניות) באופן מהימן לזהות הנייח ושלבים נודדים. זיהוי מדויק של משך השלבים הנייחים ונדידה הוא חיוני לפרשנות חד המשמעית של תוצאות. גם בצענו רכישות מרובות z שלב כדי לפקח הגירת neuroblasts ב-3D. הדמית ניאון שדה רחב כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש נדידה עצבית 7-10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתיוג neuroblasts, ביצוע וידאו בזמן אמת הדמיה של הגירת neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי העכבר המבוגר, וניתוח נדידת תאים. בעוד הפרוטוקול המתואר הודגם ההגירה של neuroblasts במבוגר RMS, זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר נדידת תאים במוח לאחר לידה עוברי ומוקדם.
Protocol
1. תיוג מבשרי נוירונים
Neuroblasts ניתן דמיין באמצעות עכברים מהונדסים כי סלקטיבי מבטאים חלבוני ניאון בneuroblasts (כלומר, DCX-GFP, Gad67-GFP), על ידי הזרקת חלקיקים נגיפיים מקודדים חלבוני ניאון לSVZ או RMS stereotaxically, או על ידי השתלת מבשרי נוירונים מעכברי כתב (כלומר , DCX-GFP, Gad67-GFP) לSVZ של עכברי סוג פראי. אנו מתארים את הליך השתלה ותיוג נגיפי של מבשרי נוירונים.
התפרקות של neuroblasts מSVZ של עכברי כתב
- את הפתרונים הבאים נדרשים לניתוק neuroblast.
פתרון 40X
10 מיליליטר העט / Strept (10000 1000 מיקרוגרם מלאי פן u / ml / Strept / מ"ל)
10 המ"ל גלוקוז (במלאי 200 מ"ג / מ"ל)
פירובט נתרן המ"ל 20 (100 מ"מ המלאי)
ove_content "> 10 המ"ל H 2 Oהכן 1 aliquots המ"ל
פתרון דיסקציה (100 מ"ל)
HBSS 1X - 97.4 מ"ל
HEPES (1 מ ') - 0.1 מ"ל
פתרון 40X - 2.5 מ"ל
DNase פתרון (20K יחידות / מ"ל)
DNaseI, typeIV מלבלב שור
150.000 יחידות מתמוססות ב7.5 המ"ל H 2 O
מסונן 0.22 מיקרומטר
הכן 1 aliquots המ"ל
טריפסין-DNaseI פתרון (10 מ"ל)
HBSS - 8.6 מ"ל
DNaseI (20K יחידות / מ"ל) - 0.15 מ"ל
טריפסין-EDTA (0.5%) - 1 מ"ל
פתרון 40X - 0.25 מ"ל
פתרון טחינה דקה (50 מ"ל)
ntent "> בינוני Neurobasal - 47.5 מ"לBSA (300 מ"ג / מ"ל) - 332.5 μl
פתרון 40X - 1.25 מ"ל
DNaseI (20K יחידות / מ"ל) - 0.66 מ"ל
- הרדם שני לעכבר בוגר 3 בן חודש מבטא חלבון פלואורסצנטי בneuroblasts עם הזרקת intraperitoneal של 100 μl של קטמין / xylazine (10 מ"ג / 1 מ"ג לכל 10 גרם של משקל גוף), ואז לערוף. אנו משתמשים בעכברים GAD67-GFP 11. שימוש באזמל, פורס את מוח coronally ברמה של חדר הצדדי, ולנתח את SVZ במדיום נתיחת קרח קר. הנח SVZ בצינור microcentrifuge עם 500 μl של פתרון טריפסין-DNase, ולשמור על קרח למשך 20 דקות.
- העברת SVZ לתוך צינור חרוטים 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של טרום התחממו (37 ° C) פתרון טריפסין-DNase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 5% למשך 30 דקות.
- להעביר את כל התכולה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של tritפתרון uration וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 1 דקות. לשאוב supernatant, להוסיף 10 מ"ל של פתרון טחינה דקה, להעביר את התאים לצינור חדש 15 מיליליטר חרוטים, וצנטריפוגה XG ב 1000 עבור 1 דקות.
- אש ללטש פסטר פיפטה כדי להקטין את גודל קצה והמעייל עם טחינה דקה בינוני. צנטריפוגה הבאה להסיר כמה שיותר את supernatant ככל האפשר, ולהוסיף 2 מ"ל של תמיסה טרייה טחינה דקה לצינור חרוטים. Triturate תאים בפתרון הטחינה הדקה (בערך 50 פעמים מעלה ומטה עם פיפטה פסטר). קח את המחצית העליונה של supernatant, המכילה תאים גם ניתקו, ולהעביר אותו לתוך צינור חדש 15 מיליליטר חרוטים המכיל 10 מ"ל של פתרון טחינה דקה.
- אש פולניה פסטר פיפטה כדי לצמצם עוד יותר את גודל הטיפ. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך פתרון טחינה דקה לצינור המכיל את תאי undissociated הנותרים, ממשיך הטחינה הדקה (בערך 10 פעמים למעלה ולמטה), ולהעביר את כל התכולה לcontainin צינור חרוטי 15 המ"לg תאים בעבר מנותק. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 7 דקות. בטל supernatant, מחדש להשעות את תאי pelleted ב50 מ"ל של מדיום neurobasal, עומס לתוך תא ספירה, וספירת התאים.
שתל את המספר הרצוי של תאים לתוך SVZ באמצעות ההליך מתואר להלן.
הזרקת Stereotaxic של הווירוס והשתלה של תאים ניתקו
- לעקר את כל המכשירים באמצעות מעקר חרוז לפני תחילת הניתוח.
- לזריקות stereotaxic, השתמש micropipettes זכוכית עם טיפים דקים מאוד (1-2 מיקרומטר) כדי למזער את הניזק מוחי. כדי להפוך פיפטה, למשוך זכוכית נימים עם חולץ פיפטה. מילוי פיפטה עם שמן פרפין עד חצי מלא, ולהכניס את הבוכנה של מזרק Nanoliter (מכשירי Precision העולם) לסוף המטופל של פיפטה.
- שימוש במזרק Nanoliter בקר, לאלץ את מטה נפט עם הבוכנה, עד dro קטןעמ 'של שמן פרפין extrudes מהקצה הדק. מנמיך את פיפטה לתוך כלי קיבול סטרילית עם 0.5-1 μl של תמיסה המכילה גם חלקיקים נגיפיים (1x10 6-1x10 8 TU / מ"ל) או תאי SVZ ניתקו. השתמש בפונקציה לסגת מNanoliter המזרק למילוי פיפטה עם הפתרון הרצוי. ודא שאין בועות אוויר בתוך פיפטה.
- הרדם שתי לC57Bl שלושה חודשים בן המבוגר / 6 עכבר עם זריקת intraperitoneal של קטמין / xylazine. השתמש במכונת גילוח חשמלית לגילוח אתר ניתוח בראשו. לנקות היטב עם גזה רטובה כדי להסיר שיער חסיד.
- הנח את העכבר על מסגרת stereotaxic ולתקן את הראש. שטוף את אזור ההזרקה ללא שיער עם סבון חיטוי (Hibitane) ולאחר מכן עם אלכוהול 70% (גזה או תרסיס). לחטא את האתר עם Proviodine (גזה או תרסיס) ולכסות את החיה בשדה ניתוח.
- לעשות חתך קטן בעור העיקור של העכבר, ולהפיץ את העור כדי לחשוף בזהירותהגולגולת שמתחת. ייבש את פני השטח של הגולגולת. השתמש בגבחת וקו האמצע כקואורדינטות אפס להגדיר (ML) את קואורדינטות stereotaxic האחוריות anterio-(AP) וMedio צדדיים, בהתאמה.
- לקדוח חור קטן בגולגולת מעל כל המיספרה בקואורדינטות המתאימות. להימנע מהניזק לרקמת המוח הבסיסית. לקדוח בזהירות עד שרק העצם נפרץ. נקה את החור ולהגדיר את הקואורדינטות לאפס (DV) את קואורדינטות stereotaxic dorso-הגחון על פני השטח של המוח. אנו משתמשים בבעקבות קואורדינטות (במ"מ) לזריקות לתוך SVZ או RMS של מבוגרים (22-24 גרם) C57Bl / 6 עכברים: לSVZ: AP 0.70, 1.20 מ"ל ו DV 1.90; לRMS: AP 2.55, 0.82 מ"ל ו DV 3.15.
- לאט לאט להכניס את קצה micropipette הזכוכית לתוך המוח באמצעות קואורדינטות DV המתאימות להם מדריכים, ולהזריק לאט כמות קטנה (אנחנו מזריקים 100-500 nl ב 5 nl / sec) של השעית תא (ניתק מSVZ של עכברי כתב) או תמיסה המכילה חלקיקי נגיף. אנחנו בדרך כלל להשתמשlentiviral או retroviral חלקיקי 1x10 6-1x10 8 TU / מ"ל.
- לאט לסגת micropipette הזכוכית, לתפור עור על הגולגולת, והנח את העכבר על משטח חימום להתאוששות מהירה יותר. כאשר סמן העכבר מתעורר לאחר הניתוח, לנהל משכך כאבים (ketaprofen 10 מ"ג / ק"ג, SC, הזרקה 1 ליום במשך 3 ימים לאחר ניתוח).
2. הכנת פרוסות חריפות
- את הפתרונים הבאים נדרשים להכין פרוסות חריפות:) נוזל מלאכותי cerebro-שדרה (ACSF) פתרון מבוסס סוכרוז, להלן פתרון חיתוך, שם NaCl הוא הוחלף על ידי סוכרוז כדי לצנן את הרגישות עצבית מוגברת במהלך הליך הכנת הפרוסה, ו ב) ACSF המכיל NaCl, חמם עד 32 מעלות צלזיוס באמבט מים, שאליו את הפרוסות מועברות ונשמרו עד הדמיה.
- הפתרונים כוללים את הדברים הבאים (במ"מ): פתרון חיתוך: 210.3 סוכרוז, 3 KCI, 1.3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CaCI 2 2 O 26 3 NaHCO, 1.25 nah 2 PO 4, 20 גלוקוז; ACSF: 125 NaCI, 3 KCI, 1.3 MgCI 2 x6H 2 O, 2 CaCI 2 x2H 2 O, 26 3 NaHCO, 1.25 nah 2 PO 4, 20 גלוקוז. שמור את הפתרונים ב-pH של 7.3-7.4, והרף על ידי חמצן מבעבע אותם עם 95% O 2/5% CO 2.
- הרדם עכבר עם ממשל intraperitoneal של קטמין / xylazine. הכן את פתרון חיתוך קר כקרח עם מראה דמוי ג'לי באמצעות חנקן נוזלי. תנקב את עכבר intracardiacaly עם הפתרון הזה באמצעות מזרק 20-סמ"ק.
- הליך זה צריך להתבצע במהירות, בדרך כלל 1-2 דקות עבור 20 מ"ל של תמיסה. אם כלי הדם צריכים להיות מתויג, במקום מרוסס עם פתרון החיתוך, להזריק transcardiacally 200 μl של dextran טקסס אדומה (10 מ"ג / מ"ל) לתוך החדר השמאלי של הלב ולהמתין 2-3 דקות לפני עריפת ראשו של העכבר.
- לערוף מ 'ouse, ומהירות לטבול את הראש בקרח קר פתרון חיתוך. השתמש במספריים כדי להסיר את הקרקפת, ולחתוך את הגולגולת מציר האחורי לקדמי לאורך תפר אמצע sagital מהמוח הקטן ליולדות. בעדינות להסיר את דשי הגולגולת באמצעות מלקחיים.
- בלו חלק הזנב של המוח באמצעות אזמל. חותך את המוח לאורך סדק intrahemispheric, ולהפוך את שני חתכי sagittal בחלק הצדדי ביותר של כל המיספרה (איור 1 א). סור בעדינות את המוח בעזרת מרית, ומקם אותו בפתרון חיתוך קרח קר.
- מניח את שני חצי בנפרד על 4% בלוק אגר עם הצד הגבה נוגע אגר, ודבק הבלוק עם שתי ההמיספרות לפלטפורמה של vibratome. דבק לקצץ רוחבי צד של חץ הכדור לפלטפורמה, שמירה על צד המדיאלי פונה כלפי מעלה (האיור 1B). הנח את הפלטפורמה בלשכת vibratome ולמלא אותו עם חיתוך פתרון. שמור את פתרון חומץ לאורך SLIהכנה לספירה על ידי מבעבע אותו עם 95% O 2/5% CO 2.
- הכן 250 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות vibratome. אנו משתמשים Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) ולפרוס את הפרוסות בתדר של 100 הרץ ומהירות של 1 מ"מ / שנייה. מהירויות חיתוך נמוכות ורעידות להב תדירות גבוהה יש להשתמש כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה. ברגע שהוא משתחרר מפרוסת הלהב, בעדינות להסיר אותו מפתרון החיתוך ולמקם אותו בחדר מלא בדגירת ACSF החומץ נשמר על 32 מעלות צלזיוס באמבט מים (האיור 1C).
הליך זה צריך להתבצע מהר ככל האפשר על מנת להבטיח את הפרוסות באיכות הטובה ביותר.
3. הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast
ההדמיה של neuroblasts הנודד צריכה להתבצע בתוך 6-8 שעות של ההכנה ופרוסות 3-10 ימים לאחר תיוג neuroblasts. כדי להימנע משינויים בפרמטרי הגירהבגלל זריקת stereotaxic שיניע את הניזק מוחי וmicroelectrodes גליה הפעלת שימוש דק בקצות זכוכית (1-2 מיקרומטר) כדי למזער את הניזק למוח, ולבצע הדמיה באזורי דיסטלי מהאתר של הזרקה (כלומר בתמונה הבאה RMS הזרקה לתוך SVZ או בRMS של נורת חוש ריח לאחר הזרקה לתוך RMS). למרות שניתן לבצע את ההדמיה ל21 ימים לאחר הזרקה של חלקיקי lentiviral לSVZ, אנו ממליצים מרווח לאחר הזרקה קצר יותר (3-10 ימים) שכן הוא מאפשר הדמיה ומעקב יותר תאים לשדה ראייה.
אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ שדה רחב ניאון ממונע BX61WI (אולימפוס) המצויד במצלמת CCD (CoolSnapHQ2, Photometrics) וטבילה במים אובייקטיבי 40X עם צמצם מספרי 0.8 (אולימפוס). המטרות עם NA הגבוה תספקנה תמונות ברזולוציה טובות יותר. neuroblasts תווית (מורכב גם מעכבר תורם כתב או באופן ויראלי שכותרת) היה נרגשעם מבדה DG-4 מצוידת ב175 ואט מנורת קסנון (סאטר מכשירים) ל30-100 msec לרכישת z. הדמיה בעל אורך גל ניתן גם לבצע באמצעות מערכות סינון מתאימות (Chroma) כדי לעקוב אחר נדידה עצבית לאורך אלמנטים האחרים הסלולר של RMS, כגון האסטרוציטים כותרתו fluorescently או כלי דם. מיקרוסקופ, מצלמת CCD וDG-4 היו בשליטת MetaMorph תוכנה (התקנים מולקולריים), שאפשרה את הפרמטרים השונים של תכנית רכישת זמן לשגות להיות מוגדרים (ראה להלן). את הפרוסות הועברו לPH1 סדרת 20 הדמיה קאמרית אולטרה שקט (הרווארד Apparatus), שנבנה במיקרוסקופ. הקאמריים היה מחובר למערכת חימום אוטומטית (TC-344B, הרווארד Apparatus) ורציפות היה perfused עם ACSF חומץ (1D איור). הטמפרטורה בתא נשמרה ב31-33 מעלות צלזיוס, וקצב הזרימה של ACSF היה 1-2 מ"ל לדקה.
- בזהירות להניח את הפרוסה בתא ההדמיה של המיקרוסקופ. אללהימנע מהיסחפות של פרוסה במהלך הדמיה, לייצב אותו על ידי הצבת רשת ניילון (וורנר מכשירים) על גבי הפרוסה בזהירות. הרשת היא 0.12 מ"מ עובי ומגוון הפתחים 0.3-1.13 מ"מ. מקם את הרשת, כך שהוא אינו מסתיר את שדה ההדמיה (1D איור). השתמש אובייקטיבי 10X למצוא תחום העניין, ולאחר מכן לעסוק האובייקטיבי 40X ולהתאים את הפוקוס.
- ודא שהפרוסה היא perfused רציפות עם ACSF ושיש מספיק פתרון בין המטרה והפרוסה. שינויים בשער של זלוף ACSF, זלוף לא סדיר, או וריאציות טמפרטורה קיצוניות גורמת נסחף ושינויים במישור המוקד במהלך הדמיה.
- הגדר את הפרמטרים לרכישת זמן לשגות (משך כלומר של עירור, מספר מטוסי z, מרחק בין Z-סעיף, מרווח זמן, ומשך ההקלטה) באמצעות תוכנת MetaMorph, השולטת ברכישת המערכת ולהתחיל בזמן תפקע רכישה. דאta נשמר אוטומטית על ידי MetaMorph כקובצי TIFF עם כל קובץ מתאים לנקודת זמן אחת הווידאו רכש זמן לשגות.
- לבצע ההדמיה של לפחות 1-2 שעות ולקחת בשלבים נודדים תמורה שנותקו על ידי שני שלבים נייחים. ההדמיה יכולה להתבצע לעד 4 שעות (לא לבצע הפעלות הדמיה שנמשכו יותר מ 4 שעות) ללא ביצוע שינויים במאפייני ההגירה של neuroblasts. אין תמונת תאים על פני השטח של הפרוסה. אנחנו בדרך כלל תמונה בעומק של 20 עד 100 מיקרומטר. אנו ממליצים להשתמש במרווחי זמן קצרים רכישה (15 - 30 שניות) אמין כדי לקבוע את תחילתו וסופו של שלבי הגירה והנייח.
- כדי להעריך את מעורבותם של גורמים מולקולריים ספציפיים בהגירה של מבשרי נוירונים, ACSF הרגיל ניתן להחליף עם ACSF המכיל כל סוכן תרופתי רצוי (כלומר, אגוניסטים שונים, יריבים, חוסמים, גורמי גדילה, וכו '). בצע הדמיה לפחות1 שעה בתנאי בקרה ולאחר מכן לשעה 1 בנוכחות התרופתית.
4. ניתוח הגירת Neuroblast
אנו משתמשים בתוכנת Imaris (Bitplane) כדי לנתח את הנתונים. זה מאפשר לנו לעקוב אחר נדידת תאי יילוד ב3D באופן אוטומטי. החבילה כוללת 7.0F1 Imaris MeasurementsPro, Imaris מעקב, ImarisColoc, ImarisXT, הנימה נותבה, ומודולים InPress.
- כדי לפתוח את הסרט בImaris, לטעון את התמונות שנרכשו (קובצים TIFF), פשוט על ידי גרירה ושחרור התמונה של נקודת הזמן הראשונה של וידאו על סמל התכנית.
- ברגע שהסרט נטען, להתאים את הבהירות והחדות של האות בחלון התאמת התצוגה, ולהגדיר את הפרמטרים של וידאו הנרכש (גודל voxel ומרווח זמן) במאפייני התמונה והגדרת מרחק שווים נקודתי זמן חלונות (איור 4 א) . לאחר ציון גודל voxel, ניתן לראות במסגרת 3D, כמו גם את הזמן והסולם שלוידאו.
- באופן אוטומטי כדי לעקוב אחר תאים מוקלטים, ליצור מקום לכל תא בתחום בחלון לעלות על ידי בחירת פונקצית כתמים. בצע את השלבים, ולהגדיר את הפרמטרים המבוססים על אובייקטי ההדמיה (איור 4 ב). אחד הפרמטרים הוא הקוטר של התא שניתן למדוד בחלון הפרוס.
- בדוק את מהימנותם של האובייקטים שאותרו לאורך זמן. אם כל התאים הנודדים אינם מזוהים באופן אוטומטי, לשנות את סף זיהוי (איור 4 ב), ולוודא שכל התאים שנבחרו עם כתמים בכל נקודתי הזמן.
- במהלך מעקב אוטומטי, אם שני אובייקטים מנקודתי זמן ובשכנות לי חפיפה בין הגבולות / קצותיהם, חיבור מסלול ייעשה עבור כל חפיפה. המרחק המרבי וגודל פער מרבי (האיור 4C) בין שתי נקודות המייצגות נקודתי זמן סמוכות של אותו המסלול צריכים להיות מוגדר כך שהתכנית יכולה להתחבר פואנקרה הזמןts. המרחק המרבי נקבע על ידי המרחק בין אותו האובייקט בנקודתי זמן שלאחר מכן.
- ברגע שהמסילה מבוצעת, ניתן לסנן את המסלולים ולהסיר רצועות לא רלוונטיות, פשוט על ידי מחיקתם (האיור 4C). מסלולים ניתן לתקן על ידי חיבור וניתוק רצועות שונות ונקודתי זמן שונות של אותו המסלול (4C איור).
- ברגע שכל התיקונים שנעשו, תיקח המבט אחרון במסילה ולייצא את הנתונים (עקירת תא לכל נקודת זמן, אורך מסלול, אורך עקירה, משך מסלול, וכו ') לקובץ Excel (האיור 4D).
5. נציג תוצאות
בדקנו ומותאם הדמית זמן לשגות שדה הרחב של הגירת neuroblast. תיוג נגיפי או השתלה של neuroblasts כותרתו fluorescently לSVZ אפשר ביטוי של GFP חזק בתאים נודדים (איור 2). הדמיה בעל אורך גל יכולה bדואר מיושם לדמיין הגירת neuroblast יחד אלמנטים סלולריים אחרים של RMS כגון כלי dextran TexasRed מלא דם 4 (איור 3 וסרט 1), האסטרוציטים, שכותרתו fluorescently בזריקת stereotaxic של וירוסים עם אמרגן גליה תא ספציפי (האיור 2B) 12, או שכותרתו במיוחד בבעלי חיים מהונדסים האסטרוציטים.
סרטון הדמית שדה הרחב של הגירת neuroblast בפרוסות חריפות חשפה התנהגות הקופצנית של נודד מבשרי נוירונים מורכבים משני שלבים ברורים: העקירה של גוף התא העצבי כלפי התהליך המוביל המופרדים בשלב נייח (איור 3, סרטי 1 ו 2) . אמין כדי לזהות את משך השלבים הנייחים ונודדים לגזור פרמטרי נדידת תאים אחרים כגון שיעור של עקירה (מחושב רק בשלבי ההגירה), הדמיה בוצעה ב3D באמצעות רכישת מרווח קצר (פעם אחת לכל 15 או 30 שניות). זיהוי המדויק של המשכים של שלבים הנייחים והגירה הוא חיוני לפרשנות חד המשמעית של נתונים. לדוגמה, הבדלים במרחק של הגירה במהלך תקופת זמן נתונה יכולים להיגרם גם על ידי שינויים בשיעור של ההגירה או על ידי שינויים בזמן או המחזוריות של ההגירה ושלבים נייחים. אפשרויות שונות אלה לא ניתן להבדיל באמצעות רכישת מרווחים ארוכים.
Imaris תוכנה שמשה כדי לנתח את ההגירה של neuroblasts ב-3D ולהפיק פרמטרים נוספים של נדידת תאים כגון משך מסלול ואורך מסלול, כמו גם אורך מסלול עקירה, שהוא וקטור של עקירה. זקיפות המסלול ניתן גם מחושב על ידי חלוקת אורך המסלול באורך מסלול העקירה והוא מציין זקיפותו של מסלול הנדידה של neuroblast פרט.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
איור 1. ייצוג סכמטי של הכנת פרוסות חיות חריפות.) ייצוג סכמטי של אחד זנב, אחד intrahemispheric ושני חתכי sagittal. B) ייצוג סכמטי של צבת מוח העכבר על לחסום אגרו והפלטפורמה של vibratome. ג) ייצוג סכמטי של תא דגירת פרוסה חריפה. ד) ייצוג סכמטי של חדר ההדמיה הבנויה על מיקרוסקופ הזקוף.
איור 2. התיוג של neuroblasts בRMS. תמונה) נמוכת הגדלה מראה תיוג חזק של neuroblasts וכלי דם בRMS המבוגר. GFP קידוד רטרווירוס הוזרק לSVZ, ותאי ה-GFP להביע-(ירוק) זוהו בRMS לאחר 3 ימים (פנל שמאלי). כלי דם תויגו על ידי הזרקת dextran TexasRed אל לבו של העכבר (אדום, פנל ימני). ההבלעה מראה magnific גבוהתמונת ation של כלי דם וneuroblasts כותרת virally קשורים בכלי דם. B) תיוג של אלמנטים שונים בסלולריים RMS המבוגר. Neuroblasts תויגו על ידי הזרקת lentivirus mCherry קידוד בSVZ (אדום), האסטרוציטים תויגו על ידי הזרקת GFP קידוד lentivirus תחת השליטה של אמרגן GFAP בRMS (ירוק), וכלי דם תויגו על ידי הזרקת dextran CascadeBlue (כחול ) בלב. ג) ייצוג סכמטי של ההזרקה של תאי GAD67-GFP ניתקו מSVZ של עכבר GAD67-GFP לתוך SVZ של עכבר בוגר פרוע סוג. ד) תאי GAD67-GFP מושתלים (ירוק) זוהו ב7 הימים לאחר השתלת RMS בSVZ. RMS הוא immunostained עם GFAP (כחול). E) תאי GAD67-GFP מושתלים (ירוק) היו immunopositive לDCX (אדום), אך היו immunonegative לGFAP (כחול). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. הדמית זמן לשגות של neuroblasts. הדמית זמן לשגות של neuroblast (ירוק) הגירה לאורך כלי דם (אדום). החצים מציינים את שלבי ההגירה של neuroblasts, ואת ראשי החץ מצביעים על השלבים הנייחים.
איור 4. הניתוח של הגירת neuroblast. (AD) שלבים שונים של ניתוח הגירת neuroblasts. העיגולים האדומים מציינים את הפונקציות השונות המוזכרות בטקסט. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
וידאו 1. זמן לשגות הדמיה של neuroblasts מתויג באופן ויראלי (ירוק) נודדות יחד dextran TexasRed כלי דם שכותרתו (אדום). Cללקק כאן לצפייה בוידאו.
וידאו 2. מעקב הגירת neuroblast ידי תוכנת Imaris. נקודות ירוקות מציינות גופי תא ומסלולים מציינים את המרחק של הגירה. לחצו כאן לצפייה בוידאו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המיקוד הנכון של מבשרי נוירונים לאזורי המוח המתאימים הוא תהליך יסוד של ההרכבה והתפקוד התקין של מעגלים עצביים. הרוב המכריע של תאים נודדים במהלך התפתחות עוברית ובמוח לאחר הלידה רק בכמה אזורים, כגון gyrus OB, המשונן ומוח הקטן, התזוזה עצבית עדיין מתרחשת. המנגנונים מנצחים נדידת תאים במוח לאחר הלידה יישארו, לעומת זאת, הבינו היטב. ידע של המנגנונים מולקולריים המעורבים ובשבילים המנחים נדידת תאים ברקמות עצבים בוגרות יהיה לשפר את ההבנה של מיקוד עצבי במוח לאחר הלידה ועשוי להיות רלוונטי קלינית לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי לגרום לגיוס עצבי לאזורים פגועים של המוח.
בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול לנדידת תאי ניטור בפרוסות חריפות של המוח הקדמי העכבר הבוגר. בעודנו מנצלים את מבוגר SVZ-OBמסלול כמודל למערכת, באותה הטכניקה יכולה להיות מיושם על מעקב נדידת תאים במוח לאחר הלידה העוברי ומוקדם, כמו גם בפגיעה בעקבות המוח הבוגרת. אנחנו השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לעקוב אחר נדידת תאים בתחילת 12 RMS לאחר הלידה, המוח הקטן וסטריאטום מבוגרים לאחר שבץ (Eiriz, כיתה, Malva וSaghatelyan, נתונים שלא פורסמו).
הדמיה של הגירת neuroblast בוצעה באמצעות פרוסות חריפות חיות, המאפשרות נדידת תאים להיחקר בmicroenvironment שמחק באופן הדוק בתנאי vivo. תאים נודדים שדמיינו או על ידי זריקות stereotaxic של חלקיקים נגיפיים או על ידי השתלת neuroblasts מעכברי כתב לתוך SVZ של עכברי סוג פראי. ניתוח ההגירה בוצע הרחק ממקום הזריקה. ללמוד הגירה משיקה בRMS, הכינו פרוסות חריפות 3-5 ימים לאחר neuroblasts תויגו. ללמוד הגירה הרדיאלי בOB, את הפרוסות היו מוכנות 7-10 ימים לאחר steהזרקת reotaxic לSVZ. מיקוד הנגיפי של מבשרי נוירונים במבוגר SVZ יכול לשמש גם כדי ללמוד ולווסת את הגורמים מעורבים בתהליך ההגירה על ידי upregulating או downregulating רמזים מולקולריים ספציפיים. אפשר גם לתייג תאים מסוגים שונים בRMS ולבצע הדמיה רבת גל לפענח את הדפוס של הגירת neuroblasts יחד כלי מעקב מלאים דם 4, 13 או האסטרוציטים שכותרת יחד אופן ויראלי או גנטית 2, 12.
להגירת neuroblast תמונה שהשתמשנו במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף ממונע מצויד במצלמת CCD שאפשרה רכישות מהירות יחסית במישורים שונים z הבא פולסים קצרים (30 100msec) של אור עירור. זה מנע photobleaching וירידת מרווח הזמן בין שתי הרכישות הבאות מבלי להפריע להדמית 3D של הגירת neuroblast. קבוצות אחרות השתמשו במיקרוסקופי confocal או שני פוטונים כדי לפקח migr תאation בRMS לאחר לידת 14-16. שני הטכניקות יש יתרונות ומגבלות הקשורות בעיקר לנושאי החלטות זמן ובמרחב. אנו ממליצים להשתמש בפרקי זמן קצרים (15-30 שניות) בין רכישות רצופות. נוירונים יילוד יש התנהגות קופצנית, ושלבי הגירה מפסיקים את התקופות נייחות שיכול להיות קצר ככל 4-10 דקות 4. בהתחשב בזה הסוג של הגירה, חשוב להשתמש במרווחי רכישה מהירים יחסית (15-30 שניות) בין נקודתי זמן רצופות באופן מהימן לזהות את ההתחלה והסוף של הגירה ושלבים נייחים. זה קשה להשגה, כאשר מרווח הזמן בין שתי רכישות רצופות הוא בטווח של כמה דקות. קביעה מדויקת של שלבים הנייחים והגירה נדרשה באופן חד משמעית להגדרת המהירות של הגירת neuroblast, שאמור ניתן לכמת רק בשלבי ההגירה 4, 17. מרווחי רכישה ארוכים מאפשרים לחשב את הבסיס הממוצעמהירות דואר כמרחק שעברה במשך תקופה מסוימת של זמן, שכוללת גם את השלבים נייחים. שינויים במהירות הממוצעת שהוגדרה על ידי שיטה זו, לעומת זאת, יכולים להיגרם גם על ידי הבדלים בשיעור של הגירה (מוגדר רק בשלבי הגירה) או על ידי משך שלבי הגירה והנייחת. הבדלים אלו בפרמטרים לרכישה צפויים בבסיס את ההבדלים במהירויות של הגירת neuroblasts דווחה על ידי קבוצות שונות. על ידי ביצוע רכישות מהירות עם מרווח 15-30 שניות וקביעת שיעור ההגירה באופן בלעדי במהלך שלבי ההגירה, חשבן מהירות ההעברה של 120-150 מיקרומטר / שעת 4, 12, ואילו קבוצות אחרות, שמשתמשים במרווח רכישה 3-7 דקות דיווחו מהירות של 50-100 מיקרומטר / h 14, 15, 18. החסרון העיקרי של הדמית ניאון שדה רחב עם מצלמות CCD הוא שהיא מספקת רזולוציה מרחבית נמוכה ממערכות סריקה. עם זאת, מאז neuroblasts הנודד יש morp קומפקטיhology עם סומה והובלת תהליכים קצרה, ברזולוציה מרחבית נמוכה אינה מונעת את זיהוי ומעקב האמין של neuroblasts ברמה של גופי תא ותהליכים אפילו מובילים (איור 3 וסרטונים 1 ו 2).
הטכניקה שנתאר להלן מאפשרת הגירת neuroblast בmicroenvironment מקרוב מחק בתנאי vivo כדי להיות מנותח, את יחסי הגומלין בין מרכיבים שונים של RMS להיחקר, ואת התפקידים של אינטראקציות אלה בהגירת neuroblast להיחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי לבריאות מחקר (CIHR) המענק לASJK מומן בהחלק על ידי מלגת אוול אוניברסיטה. AS הוא הנמען של קנדה מחקר קתדרת neurogenesis לאחר הלידה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
