Summary
우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.
Abstract
새로운 기능 뉴런이 constitutively 성인 포유류의 뇌의 제한된 영역에서 신경 줄기 세포의 내생 풀에서 생성을 나타내는 증거의 상당한 몸이있다. subventricular 영역 (SVZ)에서 신생아 neuroblasts는 후각 망울 (OB) 1에서의 최종 목적지까지의 뱃 부리 장식이있는 철새 스트림 (RMS)을 함께 마이그레이션. RMS에서 neuroblasts은 구조 지원 및 마이그레이션 4,5에 필요한 분자 요소의 소스로 혈관을 사용하여 astrocytic 프로세스 2,3에 의해 ensheathed 체인에 tangentially 마이그레이션. OB에서 neuroblasts는 체인에서 분리하고 interneurons로 차별화하고 기존의 네트워크 1, 6에 통합 다른 안구 레이어로 방사상으로 마이그레이션됩니다.
이 원고에서 우리는 쥐의 뇌의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션에 대한 절차를 설명합니다. 급성 조각의 사용은 assessm 수 있습니다밀접하게 생체 조건과 생체 이미징에 대해 액세스하기 어렵 뇌 영역에서에 유사한하는 microenvironment의 세포 마이그레이션 다닐. 또한, 결국 세포의 이주 속성을 변경할 수도 있습니다 organotypic과 셀 문화의 경우에서와 같이 긴 배양 조건을 방지합니다. 급성 조각의 Neuronal 전구체는 DIC 광학 또는 형광 단백질을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 야생 형 생쥐의 SVZ에 기자 마우스에서 neuroblasts을 접목하고, neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 사용하여 SVZ의 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨은 neuroblasts을 표시하고 이전에 따라에 대한 모든 적합한 방법입니다. 나중에 방법은 그러나, 개별 셀 때문에 분류 세포의 높은 밀도의 장기간 추적 할 수 없습니다. 우리는 비교적 빠른 수집 간격 (한 IMA 달성하기 위해 CCD 카메라가 장착 된 넓은 분야 형광 수직 현미경을 사용GE 매 15 또는 30 초)가 안정적으로 고정와 철새 단계를 식별합니다. 고정와 철새 단계 기간의 정확한 식별 결과의 모호 해석에 매우 중요합니다. 우리는 또한 3D로 neuroblasts 마이그레이션을 모니터링하기 위해 여러 Z 단계 인수를 수행. 폭 넓은 분야 형광 이미징은 neuronal 마이그레이션에게 7-10를 시각적으로 광범위하게 사용되어왔다. 여기, 우리는 neuroblasts 라벨을 성인 마우스 forebrain의 급성 조각에 neuroblast 이주의 실시간 비디오 영상을 수행하고, 세포 마이그레이션을 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜 성인 RMS의 neuroblasts의 마이그레이션을 예시 있지만, 또한 배아 및 조기 출생 후의 두뇌에 세포 이주를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. Neuronal 전구체를 라벨
Neuroblasts 선택적으로 stereotaxically SVZ 또는 RMS에 형광 단백질을 인코딩 바이러스 입자를 주입하여 (즉, DCX-GFP, Gad67-GFP) neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 마우스를 사용하여 보여 질, 또는 기자 마우스에서 neuronal 전구체를 접목하여 (즉, 수 야생 형 생쥐의 SVZ에 DCX-GFP, Gad67-GFP). 우리는 접목와 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨에 대한 절차를 설명합니다.
기자 마우스의 SVZ에서 neuroblasts의 분리
- 다음 솔루션은 neuroblast의 분리가 필요합니다.
40X 솔루션
10 ML 펜 / Strept (주식 펜 10,000 U / ML / Strept 1000 UG / ML)
10 ML 포도당 (주식 200 MG / ML)
20 ML 나트륨 Pyruvate (주식 100 ㎜)
ove_content "> 10 ML H 2 O한 ML의 aliquots 준비
해부 솔루션 (100 ML)
HBSS 1X - 97.4 ML
HEPES (1 M) - 0.1 ML
40X 솔루션 - 2.5 ML
DNase 솔루션 (20K 단위 / ML)
DNaseI, 소 췌장에서 typeIV
150,000 단위는 7.5 ML H 2 O에 용해
0.22 μm를 필터링
한 ML의 aliquots 준비
트립신 - DNaseI 솔루션 (10 ML)
HBSS - 8.6 ML
DNaseI (20K 단위 / ML) - 0.15 ML
트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.5 %) - 1 ML
40X 솔루션 - 0.25 ML
분쇄 솔루션 (50 ML)
ntent "> Neurobasal 중간 - 47.5 MLBSA (300 MG / ML) - 332.5 μl
40X 솔루션 - 1.25 ML
DNaseI (20K 단위 / ML) - 0.66 ML
- 마취는 두에 케타민을 / xylazine (10 MG / 체중 10g 당 1 밀리그램)의 100 μl의 intraperitoneal 주사로 neuroblasts에 형광 단백질을 표현 3 개월 된 성인 마우스 다음, 목을 베다. 우리는 GAD67-GFP 마우스가 11를 사용합니다. 메스를 사용 측면 심실의 수준에서 coronally 뇌를 갈라, 그리고 얼음 차가운 해부 매체의 SVZ을 해부. 트립신-DNase 솔루션 500 μl와 microcentrifuge 관에 SVZ를 놓고 20 분 동안 얼음 계속.
- 사전 예열 5 ML 포함 15 ML 원뿔 튜브에 SVZ를 전송 (37 ° C) 37시 트립신-DNase 솔루션과 품다 30 분에 5 % CO 2 ° C.
- trit 15 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 튜브에 전체 내용을 전송1 분 1,000 XG에서 uration 솔루션과 원심 분리기. 표면에 뜨는을 대기음, 분쇄 솔루션의 10 ML을 추가, 새로운 15 ML 원뿔 튜브, 1 분 1000 XG에서 원심 분리기로 세포를 전송합니다.
- 분쇄 매체와 팁 크기와 코트를 줄이기 위해 파스퇴르 피펫을 불 폴란드어. 다음 원심 분리 가능한 한 표면에 뜨는의 많은을 제거하고 원추형 튜브에 신선한 분쇄 솔루션 2 ML를 추가합니다. 분쇄 솔루션의 세포를 (파스퇴르 피펫과 약 50 배 위쪽 및 아래쪽) 씹다. 잘 dissociated 세포를 포함하는 표면에 뜨는의 위쪽 절반을, 가지고, 분쇄 솔루션의 10 ML를 포함하는 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송.
- 화재 - 폴란드어 더 팁 크기를 줄일 수있는 파스퇴르 (Pasteur) 피펫. 나머지 undissociated 세포를 포함하는 튜브로 분쇄 솔루션의 또 다른 한 ML을 추가 분쇄를 (약 10 배 위아래로) 계속하고, 15 ML 원뿔 튜브 containin에 전체 내용을 전송g 이전에 dissociated 세포. 7 분 1,000 XG에 원심 분리기. 표면에 뜨는 폐기하십시오, neurobasal 매체 계수 챔버에 부하의 50 ML에 pelleted 세포를 다시 중지하고 세포를 계산합니다.
수술이 절차를 사용하여 SVZ에 세포의 원하는 번호는 아래에 설명.
Stereotaxic 바이러스의 주입과 dissociated 세포의 이식
- 수술을 시작하기 전에 비드 살균기를 사용하는 모든 악기를 살균.
- stereotaxic 주사를 들어, 뇌 손상을 최소화하기 위해 매우 얇은 팁 (1-2 μm)와 유리 micropipettes을 사용합니다. 피펫을 만들려면 피펫을 끌어 당기는있는 모세관 유리를 당긴다. 백업은 반 전체까지 파라핀 오일과 피펫, 그리고 피펫의 치료 끝으로 Nanoliter 주입기 (세계 정밀 계측기)의 플런저를 삽입합니다.
- Nanoliter 분사기 제어기를 사용, 작은 dro 때까지 플런저로 오일 아래쪽으로 강제파라핀 오일 P는 얇은 끝에서 extrudes. 바이러스 입자 (1x10 6 1x10 8 TU / ML) 또는 dissociated SVZ 세포 중 하나를 포함하는 솔루션의 0.5-1 μl와 살균 소켓에 피펫을 낮 춥니 다. 원하는 솔루션을 피펫을 채우기 위해 Nanoliter 주입기의 철회 함수를 사용합니다. 피펫 내부 기포가 없는지 확인합니다.
- 마취 두에 케타민을 / xylazine의 intraperitoneal 주사와 3 개월 된 성인 C57Bl / 6 마우스. 머리에 수술 사이트를 면도하는 전기 면도기를 사용합니다. 모든 자기편 머리를 제거하는 서부 유럽 표준시 거즈로 잘 닦습니다.
- stereotaxic 프레임에 마우스를 놓고 머리를 해결할 수 있습니다. 살균제 비누 (Hibitane) 후 70 % 알코올 (거즈 또는 스프레이)와 함께 헤어 무료로 주사 사이트를 씻으십시오. Proviodine (거즈 또는 스프레이)로 사이트를 소독하고 수술 분야로 동물을 다룹니다.
- 마우스의 살균 피부에 작은 절개를 확인하고 조심스럽게 노출 할 수있는 피부를 확산기본 두개골. 두개골의 표면을 말린다. 각각 anterio - 뒤쪽 (AP)와 만나는-측면 (ML) stereotaxic 좌표를 설정하는 제로 좌표로 bregma과 중간 선을 사용합니다.
- 해당 좌표의 각 반구를 통해 두개골에 작은 구멍을 뚫는다. 기본 뇌 조직을 손상하지 마십시오. 만 뼈가 위반 될 때까지 조심스럽게 이동합니다. 구멍을 청소하고 뇌의 표면에 dorso-복부 (DV) stereotaxic 좌표 제로 좌표를 설정합니다. 우리는 SVZ 또는 성인의 RMS (22~24g) C57Bl / 6 마우스에 주사에 대해 (mm)를 좌표에 따라 사용 SVZ를 위해 : AP 0.70, ML 1.20 및 DV 1.90를, RMS에 대한 : AP 2.55, ML 0.82 및 DV를 3.15.
- 천천히 가이드로 적절한 DV 좌표를 사용하여 뇌에 유리 micropipette 팁을 삽입하고, 천천히 세포 현탁액의 (우리는 5시 NL / 초 100-500 NL를 삽입) 소량의 주사 (기자 마우스의 SVZ에서 dissociated) 또는 바이러스 입자를 포함하는 솔루션입니다. 우리는 일반적으로 사용lentiviral 또는 retroviral 입자 1x10 6 1x10 8 TU / ML.
- 천천히, 유리 micropipette를 철회 두개골을 통해 피부를 봉합하고, 빠른 복구를 위해 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 마우스가 수술 후 깨어 나면 관리 진통제 (ketaprofen 10 밀리그램 / kg, SC, 3 일 후 조합 중 1 일 1 주사).에게
2. 급성 슬라이스 준비
- ) 인공 cerebro - 척수 (ACSF)이 자당 기반 솔루션, 이하 NaCl은 슬라이스 준비 절차를 수행하는 동안 증가 neuronal 흥분을 저해하는 자당로 대체됩니다 절삭 솔루션이라고합니다, 다음 솔루션은 급성 조각을 준비해야합니다 및 b) NaCl을 포함하는 ACSF는 ° C 슬라이스가 이미지까지 전송, 유지되는에 물을 욕조에 32 따뜻하게.
- 절단 솔루션 : 210.3 자당, 3 KCI, 1.3 MgCI이 x6H 2 O, 2 CaCI 2 솔루션은 다음을 (MM)를 포함하는 2 O 26 NaHCO 3, 1.25 아냐 2 PO 4, 20 포도당, ACSF : 125 NaCI, 3 KCI, 1.3 MgCI이 x6H 2 O, 2 CaCI이 x2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1.25 아냐 2 PO 4, 20 포도당. 7.3-7.4의 산도에 솔루션을 유지하고, 95% O 5분의 2 % CO 2를 버블 링하여 지속적으로 산소.
- 케타민 / xylazine의 intraperitoneal 관리와 마우스를 마취. 액체 질소를 사용하여 젤리 같은 모양으로 얼음처럼 차가운 절단 솔루션을 준비합니다. 20 CC의 주사기를 사용하여이 솔루션을 intracardiacaly 마우스를 Perfuse.
- 이 절차는 솔루션의 20 ML에 대해 1 분 이내 신속하게 수행해야합니다. 혈관 대신 커팅 솔루션으로 관류의, 표시해야하는 경우, 심장의 왼쪽 심실로 Dextran 텍사스 레드 (10 MG / ML)의 transcardiacally 200 μl를 삽입하고 마우스를 목이 날아 전에 2-3 분 정도 기다리십시오.
- m 목을 벨ouse, 그리고 빠르게 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리를 빠져. 두피를 제거하고, 소뇌에서 OB에 중간 sagital 봉합을 따라 앞 축에 뒤쪽에서 두개골을 잘라 가위를 사용하십시오. 부드럽게 집게를 사용하여 두개의 날개를 제거합니다.
- 메스를 사용하여 뇌의 소비세 꼬리 부분입니다. intrahemispheric 균열 (fissure)를 따라 뇌를 잘라, 각 반구 (그림 1A)의 가장 외측 부분에 두 개의 시상 상처를합니다. 부드럽게 주걱을 사용하여 뇌를 제거하고 얼음 차가운 절단 솔루션에 배치합니다.
- 4 %의 한천 한천을 터치 등쪽면과 블록, 그리고 vibratome의 플랫폼으로 두 개의 반구로 접착제 블록을에 별도로 두 반구를 놓습니다. 접착제 측면 직시 안쪽면을 (그림 1B) 유지, 플랫폼에 반구의 측면을 잘라. vibratome의 챔버에서 플랫폼을 놓고 솔루션을 절단과 함께 입력합니다. SLI를 통해 산소 솔루션을 유지95% O 5분의 2 % CO 2로 버블 링하여 CE 준비.
- vibratome를 사용하여 250 μm 두께의 섹션을 준비합니다. 우리는 Microm HM 650 V vibratome (열 과학)를 사용, 100 Hz에서 1 ㎜ / 초의 속도의 주파수에서 조각을 잘라. 낮은 절삭 속도와 고주파 블레이드의 진동은 높은 품질 섹션을 얻기 위해 사용되어야합니다. 즉시 슬라이스가 블레이드에서 출시로, 부드럽게 커팅 솔루션에서 제거 및 32의 ° C 물 목욕 (그림 1C)에 유지 산소를 ACSF로 가득 배양 챔버에 배치합니다.
이 절차는 최고 품질의 조각을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야합니다.
3. Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상
마이그레이션의 neuroblasts의 영상은 neuroblasts 라벨 후 슬라이스의 준비 6-8 시간 및 3~10일 이내에 수행해야합니다. 이전 매개 변수의 변화를 방지하려면때문에 뇌 손상을 최소화하기 위해 뇌 손상과 glial 활성화를 사용 얇은 스쳐 유리 microelectrodes (1-2 μm)을 유도하고, 분사의 사이트에서 말초 지역의 이미지를 (RMS의 다음의 예를 들면 이미지를 수행 할 수 있습니다 stereotaxic 분사의 SVZ에 또는 후각 망울의 RMS에서 분사)는 RMS에 주사를 따라. 이미지가 SVZ에 lentiviral 입자의 주입 후 21일까지 수행 할 수 있지만이 시각화와 시야 당 세포를 추적 할 수 있기 때문에, 우리는 짧은 포스트 분사 간격 (3-10일)를 권장합니다.
우리는 CCD 카메라 (CoolSnapHQ2, Photometrics)와 0.8 수치 개구 (올림푸스)와 40X 물 침적 목표 갖춘 넓은 분야 형광 방문객 BX61WI 현미경 (올림푸스)를 사용했습니다. 높은 NA있는 목표는 더 나은 해상도 이미지를 제공합니다. 표시 neuroblasts은 (기자 기증자 마우스이나 급속도로 이루어질 표시 중 이식) 흥분했다Z 획득 당 30-100 밀리 초에 175 W 크세논 램프 (셔터 계측기)가 장착 된 람다 DG-4. 다중 파장 영상은 또 휘황 표시 astrocytes 또는 혈관으로 RMS의 다른 세포 요소, 함께 neuronal 마이그레이션을 추적하기 위해 적절한 필터 세트 (채도)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 현미경, CCD 카메라와 DG-4는 시간 경과 수집 프로그램의 다른 매개 변수 (아래) 설정해야 할 수 MetaMorph 소프트웨어 (분자 장치)에 의해 제어되었다. 조각은 현미경에 설치되어있는 PH1 시리즈 20 초 조용한 이미징 챔버 (하버드 장치)로 전송되었습니다. 챔버는 자동 난방 시스템 (TC-344B, 하버드 장치)에 연결되어 지속적으로 산소를 ACSF (그림 1D)와 perfused되었습니다. 챔버의 온도는 31-33 ° C로 유지하고, ACSF의 흐름 속도는 최소 1-2 ML였습니다.
- 현미경의 이미징 챔버에 조각을 조심스럽게 넣습니다. 에영상 중에 슬라이스의 표류하지 않도록 신중하게 슬라이스 위에 나일론 메쉬 (워너 악기)를 배치하여 안정화. 메쉬 0.3에서 1.13 mm로 0.12 mm 두께 및 개구부 범위입니다. 이 이미지 필드 (그림 1D)를 방해하지 않도록 메쉬를 배치합니다. 관심있는 분야를 찾아 10X 목표를 사용하고, 다음 40X 목표를 결합하고 초점을 조정합니다.
- 슬라이스가 지속적으로 ACSF로하고 객관적이고 슬라이스 사이에 충분한 솔루션이입니다 perfused되어 있는지 확인합니다. ACSF 재관류, 불규칙한 살포, 또는 급격한 온도 변화 떠도는 원인 및 이미징 동안 초점 평면의 변화의 속도의 변화.
- 수집 시스템을 제어 MetaMorph 소프트웨어를 사용하여 시간 경과 수집 매개 변수 (예 : 여기의 기간, z는 비행기의 번호, 각 Z-섹션 사이의 거리, 시간 간격 및 녹화 기간) 설정하고 시간을 시작 인수를 잘못됐다. 다타이 자동으로 획득 시간 경과 비디오 한 번 포인트에 해당하는 각 파일과 TIFF 파일로 MetaMorph으로 저장됩니다.
- 적어도 1-2 시간의 이미징을 수행 두 개의 고정 단계에서 중단되었습니다 고려 철새 단계로보세요. 영상은 neuroblasts의 마이그레이션 특성에 변경하지 않고 4 시간 (우리는 이상 4 시간 지속 이미징 세션을 수행하지 않았습니다) 동안 수행 할 수 있습니다. 슬라이스의 표면에 이미지 셀하지 마십시오. 20-100 μm의 깊이에서 우리는 보통 이미지입니다. 안정적으로 고정 및 마이그레이션 단계의 시작과 끝을 결정하기 위해 - 우리는 짧은 취득주기를 (30 초 15) 사용하는 것이 좋습니다.
- neuronal 전구체의 마이그레이션에서 특정 분자 요인의 참여를 평가하기 위해 일반 ACSF는 ACSF이 원하는 약리 에이전트를 (즉, 다른 agonists, antagonists, 차단기, 성장 요인 등)이 포함 된로 대체 할 수 있습니다. 이상에 대한 이미징을 수행한 제어 상태에서 시간 후 약리 에이전트의 존재에 1 시간에.
4. Neuroblast 마이그레이션 분석
우리는 데이터를 분석 할 수 Imaris 소프트웨어 (Bitplane)을 사용합니다. 이것은 우리가 자동으로 3D로 신생아 세포 이주를 추적 할 수 있습니다. Imaris 7.0F1 패키지는 MeasurementsPro, Imaris 추적, ImarisColoc, ImarisXT, 필라멘트 추적 및 InPress 모듈이 포함되어 있습니다.
- Imaris에서 동영상을 열려면, 단순히 드래그하고 프로그램 아이콘의 비디오의 첫 번째 시점의 이미지를 놓아 획득 이미지를 TIFF (파일)로드합니다.
- 동영상이로드되면, 디스플레이 조정 창에서 신호의 밝기 및 대비를 조정하고 이미지 속성에 취득 비디오 (voxel 크기와 시간 간격)의 매개 변수를 설정하고 등거리 시간 포인트 창을 (그림 4A) 설정 . voxel 크기를 지정 후 3D로 프레임뿐만 아니라 시간과 규모를 볼 수 있습니다비디오.
- 자동으로 기록 세포를 추적하려면 명소 기능을 선택하여 초과 창에서 필드의 각 셀에 대한 장소를 만들 수 있습니다. 단계를 수행하고, 이미징 개체 (그림 4B)을 기반으로 매개 변수를 설정합니다. 매개 변수 중 하나는 슬라이스 창에서 측정 할 수있는 세포의 직경입니다.
- 시간이 지남에 따라 검출 된 개체의 안정성을 검사합니다. 모든 마이그레이션 세포가 자동으로 감지되지 않으면 감지 임계 값 (그림 4B)을 변경하고 모든 셀이 모든 시간 지점에서 장소로 선택되어 있는지 확인하십시오.
- 주변 시간이 점에서 두 개체가 자신의 국경 / 가장자리 사이에 중복이있는 경우 자동으로 추적하는 동안, 트랙 연결이 각 중복에 대해 이루어집니다. 같은 트랙의 이웃 시간 지점을 대표하는 두 지점 사이의 최대 거리와 최대 간격 크기 (그림 4C)은 프로그램이 시간 poin를 연결할 수 있도록 지정해야TS. 최대 거리는 시간을 포인트 이후에 같은 개체 사이의 거리에 의해 결정됩니다.
- 트랙이 완료되면,이 트랙을 필터링하고 단순히 그 (그림 4C)를 삭제하여 관련이없는 트랙을 제거 할 수 있습니다. 트랙은 다른 트랙과 동일한 트랙의 다른 시간 지점 (그림 4C)를 연결하고 분리에 의해 수정 될 수 있습니다.
- 일단 모든 수정이 완료되었으며, 트랙에서 최종 살펴하여 Excel 파일 (그림 4D)에 데이터를 (시간 포인트 당 세포 변위, 트랙 길이, 변위 길이, 트랙 길이 등) 내보낼 수 있습니다.
5. 대표 결과
우리는 테스트 neuroblast 마이그레이션의 폭 넓은 분야 시간 경과 영상을 최적화. 바이러스 라벨 또는 이전 셀의 강력한 GFP 표현 (그림 2)를 사용할 수 SVZ에 휘황 표시 neuroblasts의 접목. 다중 파장 영상은 B 수전자는 dextran TexasRed이 가득한 혈관 4 (그림 3 및 동영상 1), 휘황 glial 세포 특정 발기인 (그림 2B) 12 바이러스의 stereotaxic 주입에 의한 표시 astrocytes와 같은 RMS의 다른 세포의 요소를 따라 neuroblast 마이그레이션을 시각화 적용 또는 구체적으로 유전자 변형 동물의 astrocytes을 표시.
고정 단계로 구분하여 선도적 인 과정에 대한 neuronal 전지 본체의 변위 (그림 3, 영화 1, 2) : 급성 조각의 neuroblast 이주의 폭 넓은 분야 비디오 영상은 두 개의 단계로 구성 neuronal 전구체를 마이그레이션의 약진 동작을 밝혀 . 고정와 철새 단계의 기간을 식별 안정적으로하기와 같은 변위 (이주 단계 중에 만 계산)의 속도로 다른 세포 이주 매개 변수를 도출하기 위해, 영상은 짧은 수집 간격 (한 번에 15 퍼센트를 사용 3D에서 수행되었다 또는 30 초)입니다. 고정 및 마이그레이션 단계의 기간의 정확한 식별은 데이터가 모호 해석에 매우 중요합니다. 예를 들어, 특정 기간 동안 이주의 거리의 차이는 마이그레이션의 속도의 변화 또는 마이그레이션 및 고정 단계 기간이나 주기성의 수정에 의해 어느 유도 할 수 있습니다. 이러한 다른 가능성은 오래 수집 간격을 사용하여 구별 할 수는 없습니다.
Imaris 소프트웨어는 3D로 neuroblasts의 마이그레이션을 분석하고 추적 기간 및 트랙의 길이뿐만 아니라 변위의 벡터이다 트랙 변위의 길이와 같은 세포 이주의 추가 매개 변수를 추출하는 데 사용되었다. 트랙 직도는 트랙 변위 길이로 트랙 길이를 나누어 계산하고 개별 neuroblast의 마이그레이션 경로의 직도을 나타냅니다 할 수 있습니다.
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1 그림. 급성 라이브 조각의 준비 개략도. 하나 꼬리 한 intrahemispheric 두 시상 상처의 A) 도식 표현입니다. vibratome의 한천 블록 플랫폼에서 마우스 뇌를 배치의 B) 도식 표현입니다. 급성 슬라이스 배양 챔버의 C) 도식 표현입니다. 직립 현미경에 내장 된 이미징 챔버의 D) 도식 표현입니다.
그림 2. RMS에 neuroblasts의 라벨. neuroblasts과 성인 RMS에서 혈관의 강력한 라벨을 보여주는 A) 낮은 배율 이미지. 레트로 바이러스 인코딩 GFP는 SVZ에 주입되었고, GFP-표현 세포는 (녹색) 3 일 (왼쪽 패널) 이후 RMS에서 발견되었습니다. 혈관 dextran는 마우스의 심장 (빨강, 오른쪽 패널)에 TexasRed 주입에 의해 표시되었다. 삽입이 높은 거룩한를 보여줍니다혈관 및 혈관과 관련된 급속도로 이루어질 분류 neuroblasts의 ation 이미지입니다. 성인 RMS에서 다른 세포 요소의 B) 레이블. Neuroblasts이 SVZ (빨간색)에 mCherry-인코딩 lentivirus을 주입하여 라벨이 붙지 만, astrocytes는 RMS (녹색)에 GFAP 프로모터의 제어하에 lentivirus 인코딩 GFP를 주입하여 라벨이 붙지 만, 그리고 혈관 Dextran CascadeBlue (파란색를 주입하여 라벨이 붙지 만 )에 위치하고 있습니다. 성인 야생 타입 마우스의 SVZ에 GAD67-GFP 마우스의 SVZ에서 dissociated GAD67-GFP 세포의 주입의 C) 도식 표현입니다. D) 이식 GAD67-GFP 전지는 (녹색) SVZ에 접목 한 후 RMS 7 일 이내에 감지되었습니다. RMS는 GFAP (파란색)와 immunostained 있습니다. E) 이식 GAD67-GFP를 세포 (녹색) DCX (빨간색)에 대한 immunopositive 있었지만, GFAP (파란색)에 대한 immunonegative 이었죠. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 혈관을 따라 neuroblast의 neuroblasts의 시간 경과 영상. 시간 경과 영상 (녹색) 마이그레이션 (빨간색). 화살표는 neuroblasts의 마이그레이션 단계를 표시하고, 화살촉은 고정 단계를 나타냅니다.
4 그림. neuroblast 이주의 분석. (AD) neuroblasts 마이그레이션 분석의 다른 단계. 빨간 동그라미가 텍스트에서 언급 된 다른 기능을 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
dextran 함께 급속도로 이루어질 분류 neuroblasts의 비디오 1. 시간 경과 영상 (녹색) 마이그레이션라는 혈관 (빨간색). TexasRed C를동영상을 보려면 여기를 핥지.
비디오 2. Imaris 소프트웨어 neuroblast 마이그레이션을 추적. 녹색 점은 세포 기관을 나타내고 트랙은 마이그레이션의 거리를 나타냅니다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
적절한 뇌 지역에 neuronal 전구체의 올바른 타겟팅은 신경 회로의 적절한 조립과 기능의 근간이 기본 과정입니다. 세포의 대부분은 배아 발달 동안 마이그레이션 만 등의 OB, 이가있는 이랑과 소뇌 등의 몇 지역에서 출생 후의 두뇌에 neuronal 변위는 아직 이루어집니다. 출생 후의 뇌의 세포 마이그레이션을 꾸미고 메커니즘이 저조한 이해하지만, 남아 있습니다. 성숙한 신경 조직에 세포 마이그레이션 가이드에 관여하는 메커니즘와 분자 경로에 대한 지식은 출생 후의 뇌 neuronal 타겟팅에 대한 우리의 이해를 개선하고 뇌의 병에 걸린 영역으로 neuronal 채용을 유도 할 수있는 새로운 전략의 개발을위한 임상 관련성이있을 수 있습니다.
이 원고에서, 우리는 성인 마우스 forebrain의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 성인 SVZ-OB를 사용하는 동안모델 시스템과 같은 경로는 동일한 기술은 배아와 초기 출생 후의 두뇌뿐만 아니라 성인 뇌에 따라 부상에서 세포 이주를 수행하는 적용 할 수 있습니다. 우리는 초기 출생 후의 RMS 12, 소뇌 및 성인 포스트 스트로크 striatum (Eiriz, 학년, Malva 및 Saghatelyan, 게시되지 않은 데이터)에 세포 이주를 수행하려면이 프로토콜을 사용했습니다.
neuroblast 마이그레이션 이미징은 세포 마이그레이션이 밀접하게 생체 조건에서 모방 microenvironment에서 공부 할 수 있도록 급성 라이브 조각을 사용하여 수행되었습니다. 마이그레이션 세포는 바이러스 입자의 stereotaxic 주사 또는 야생 형 생쥐의 SVZ에 기자 마우스에서 neuroblasts을 접목하여 하나 시각화했다. 마이그레이션 분석은 사출 사이트에서 멀리 수행되었다. RMS의 접선의 마이그레이션을 연구하기 위해 3-5 일 neuroblasts이 라벨이 붙지 후 급성 조각을 준비했습니다. OB의 반경 이주를 공부하려면 슬라이스가 7~10일 STE 후 준비되었습니다SVZ에 reotaxic 주입. 바이러스 SVZ도 공부하는 데 사용할 수있는 성인의 neuronal 전구체의 타겟팅 및 특정 분자 신호를 upregulating 또는 downregulating하여 마이그레이션 과정에 참여 요인을 조절. 이 RMS의 다른 세포 유형을 라벨 및 추적 채워진 혈관 4, 13 또는 함께 급속도로 이루어질 또는 유전자 표시 astrocytes 12 ~ 따라 neuroblasts 이주의 패턴을 해명하기 위해 다중 파장 영상을 수행 할 수도 있습니다.
이미지 neuroblast 마이그레이션에 우리는 여기 빛의 짧은 펄스 (30-100msec)에 따라 서로 다른 Z 비행기에서 상대적으로 빠른 인수를 허용 CCD 카메라가 장착 된 동력 형광 수직 현미경을 사용했습니다. 이 photobleaching 방지 및 neuroblast 마이그레이션의 3D 시각화를 방해하지 않고이 이후의 인수 사이의 시간 간격을 감소. 다른 그룹은 세포 migr을 모니터링 할 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용한출생 후의 RMS 14-16에서 ation. 두 기술은 주로 시간적 공간적 해상도 문제와 관련된 자신의 장점과 한계를 수 있습니다. 우리는 연속 인수 사이에 짧은 간격을 (15-30 초) 사용하는 것이 좋습니다. 신생아 뉴런은 약진 행동을 가지고 있고, 마이그레이션 단계는 4-10 분 4처럼 간단히 할 수 있습니다 고정 기간에 의해 중단되었습니다. 이러한 유형의 마이그레이션을 감안할 때, 그것은 안정적으로 마이그레이션 및 고정 단계의 시작과 끝을 확인하기 위해 연속 시간 지점 사이의 비교적 빠른 수집 간격을 (15-30 초)를 사용하는 것이 중요합니다. 이 두 개의 연속 인수 사이의 시간 간격은 몇 분의 범위에있을 때 달성 할 어렵습니다. 고정 및 마이그레이션 단계의 정확한 결정은 unambiguously 마이그레이션 단계 4, 17 중에 만 정량화해야 neuroblast 마이그레이션의 속도를 정의해야합니다. 긴 수집 간격은 averag을 계산 할 수 있습니다거리로 전자 속도는 고정 단계를 포함 일정 기간 동안 여행. 이 방법에 의해 정의 된 평균 속도의 변경 그러나, 마이그레이션의 속도의 차이 (이주 단계 중에 만 정의) 또는 고정 및 마이그레이션 단계 기간 중 하나로 인해 발생할 수 있습니다. 인수 매개 변수의 이러한 차이는 서로 다른 그룹에 의해보고 neuroblasts 마이그레이션의 속도에 차이가 기초가 될 가능성이 있습니다. 의 수집 간격을 사용하는 다른 그룹, 누가 반면에 15-30 초 간격으로 빠르게 인수를 수행하고 마이그레이션 단계 동안 독점적으로 마이그레이션의 속도를 결정함으로써, 우리는 120-150 μm / H 4, 12 마이그레이션의 속도를 계산 3-7 분 50-100 μm / H 14, 15, 18의 속도를보고했다. CCD 카메라로 폭 넓은 분야 형광 영상의 주요 단점은 스캔 시스템보다 낮은 공간 해상도를 제공하는 것입니다. 그러나, 이후 이주 neuroblasts은 컴팩트 morp이소마 짧은 선도하는 프로세스와 hology, 낮은 공간 해상도는 세포 기관의 수준에서 neuroblasts의 신뢰할 수있는 식별 및 추적을 배제하고도 선도적 인 프로세스 (그림 3 및 비디오 1, 2)되지 않습니다.
우리가 여기서 설명하는 기술은 밀접하게 분석 할 생체 조건에서 모방 microenvironment에 neuroblast 이주가 RMS의 다른 구성 요소 사이의 상호 작용이 공부 할 수 있고, neuroblast 마이그레이션에서 이러한 상호 작용의 역할을 조사 할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 Université 라발의 교제에 의해 지원되었다 ASJK에 건강 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. AS 출생 후의 neurogenesis에 캐나다 연구 의자의 수신자입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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