Summary
Мы описываем протокол реального времени videoimaging о миграции нейронов у мышей мозга. Миграция вирусно-меченных или привитые нейрональных предшественников был записан в остром живых срезов при использовании широкого поля флуоресцентных изображений с относительно быстрым приобретением интервал для изучения различных этапах клеточной миграции, в том числе продолжительность стационарного и миграции фазы и скорости миграция.
Protocol
1. Маркировка нейрональных предшественников
Нейробластов могут быть визуализированы с использованием трансгенных мышей, которые выборочно выразить флуоресцентные белки в нейробластов (то есть, DCX-GFP, GAD67-GFP), по стереотаксически инъекционных вирусные частицы, кодирующие флуоресцентные белки в SVZ или RMS, или путем прививки нейрональных предшественников с корреспондентом мышей (то есть , DCX-GFP, GAD67-GFP) в SVZ из мышей дикого типа. Мы описываем процедуру прививки и вирусных маркировки нейрональных предшественников.
Диссоциация нейробластов из SVZ репортера мышей
- Следующие решения, необходимые для нейробластов диссоциации.
40X решения
10 мл Pen / Strept (со Pen 10000 ед / мл / Strept 1000 мкг / мл)
10 мл Глюкоза (со 200 мг / мл)
20 мл пирувата натрия (со 100 мМ)
ove_content "> 10 мл H 2 OПодготовить 1 мл аликвоты
Препарирование раствор (100 мл)
HBSS 1X - 97,4 мл
HEPES (1 M) - 0,1 мл
40X решения - 2,5 мл
ДНКазы решение (20K ед / мл)
DNaseI, typeIV из бычьей поджелудочной железы
150000 единиц растворить в 7,5 мл H 2 O
Фильтр 0,22 мкм
Подготовить 1 мл аликвоты
Трипсин-DNaseI раствором (10 мл)
HBSS - 8,6 мл
DNaseI (20K ед / мл) - 0,15 мл
Трипсина-EDTA (0,5%) - 1 мл
40X решения - 0,25 мл
Растирание раствора (50 мл)
ntent "> Neurobasal среднего - 47,5 млBSA (300 мг / мл) - 332,5 мкл
40X решения - 1,25 мл
DNaseI (20K ед / мл) - 0,66 мл
- Anesthetize два-три-месячного взрослой мыши выражения флуоресцентного белка в нейробластах с внутрибрюшинного введения 100 мкл кетамин / ксилазина (10 мг / 1 мг на 10 г веса тела), а затем обезглавить. Мы используем GAD67-GFP мышей 11. Использование скальпеля, нарезать мозга коронки на уровне бокового желудочка, и рассекать из SVZ в ледяной среде рассечение. Поместите SVZ в микроцентрифуге трубки с 500 мкл трипсина-аз решения, и держать на льду в течение 20 мин.
- Передача SVZ в 15 мл коническую трубку, содержащую 5 мл подогретого (37 ° C) трипсин-аз решения и инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 30 мин.
- Перенесите все содержимое в 50 мл коническую трубку, содержащую 15 мл ТритРешение фигурации и центрифуге при 1000 мкг в течение 1 мин. Аспирируйте супернатант, добавить 10 мл растирания решение, передает клеток в новый 15 мл коническую трубку, и центрифуги при 1000 х г в течение 1 мин.
- Пожарные-польской пипетки Пастера, чтобы уменьшить размер зонда и пальто с растиранием среды. После центрифугирования удалить как можно больше из супернатанта насколько это возможно, и добавить 2 мл свежего раствора растирания в конической трубе. Растирают клеток в растирании раствора (примерно в 50 раз вверх и вниз с пипетки Пастера). Возьмите верхнюю половину супернатант, который содержит хорошо диссоциированных клеток, и передать его в новой 15 мл коническую трубку, содержащую 10 мл растирания решение.
- Fire-польский пипетки Пастера в целях дальнейшего сокращения размера чаевых. Добавить еще 1 мл растирания решение пробирку, содержащую оставшиеся недиссоциированной клетки, продолжают растирания (примерно в 10 раз вверх и вниз), и передать все содержимое в 15 мл коническую трубку containinг ранее диссоциированных клеток. Центрифуга при 1000 х г в течение 7 мин. Удалите супернатант, вновь приостановить осаждали клетки в 50 мл Neurobasal среды, нагрузка в счетной камере, и подсчитать клетки.
Привитые нужное количество клеток в SVZ используя процедуру, описанную ниже.
Стереотаксическая инъекцию вируса и прививки диссоциированных клеток
- Стерилизовать всех инструментов, используя бисер стерилизатора перед началом операции.
- Для стереотаксической инъекции, используйте стеклянные микропипетки с очень тонкими советов (1-2 мкм), чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга. Для того, чтобы пипетка, вытащить стеклянный капилляр с съемника пипетки. Засыпка пипетки с парафинового масла до полуготовности полном объеме, и вставить поршень Nanoliter инжектор (инструменты Всемирного Precision) в необработанном конец пипетки.
- Использование Nanoliter инжектор контроллер, заставить нефть вниз с поршнем до небольшого дрор парафиновое масло выдавливает из тонкого кончика. Опустите пипетку в стерильный сосуд с 0.5-1 мкл раствора, содержащего либо вирусной частицы (1x10 6-1x10 8 TU / мл) или диссоциированных клеток SVZ. Используйте вывести функцию Nanoliter инжектор для заполнения пипетки с искомым решением. Убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха внутри пипетки.
- Anesthetize два-три-месячного C57Bl взрослых / 6 мышей с внутрибрюшинного введения кетамина / ксилазина. Используйте электрическую бритву, чтобы побрить место операции на голове. Очистите и мокрой марли, чтобы удалить любые прикосновения волос.
- Наведите на стереотаксической рамы и зафиксировать голову. Вымойте волосы без инъекций с дезинфицирующим мылом (Hibitane), а затем с 70% спиртом (марлю или спрей). Лечить сайт с Proviodine (марлю или спрей) и покрывают животное с операционного поля.
- Сделайте небольшой надрез в стерилизованные кожи мыши, и осторожно раскрывайте кожи подвергатьосновной черепа. Высушите поверхность черепа. Используйте брегмы и средней линии, как нулевые координаты, чтобы установить anterio-задней (AP) и медио-латеральной (ML) стереотаксических координат, соответственно.
- Просверлить маленькое отверстие в черепе над каждым полушарием в соответствующих координатах. Избегайте повреждения основной ткани мозга. Просверлите осторожно, пока только кости была нарушена. Очистите отверстие и установить нулевые координаты для спинно-вентральной (DV) стереотаксических координат на поверхности мозга. Мы используем следующие координаты (в мм) для инъекций в SVZ или RMS взрослых (22-24 г) C57BL / 6: для SVZ: AP 0,70, 1,20 и ML DV 1.90; для RMS: AP 2,55, 0,82 и ML DV 3.15.
- Медленно вставьте наконечник стеклянной пипетки в мозг используя соответствующие координаты DV в качестве гидов, и медленно вводят небольшое количество (мы вводим 100-500 п на 5 л / сек) клеточной суспензии (в отрыве от SVZ репортера мышей) или Раствор, содержащий вирусные частицы. Мы обычно используемлентивирусные или ретровирусных частиц 1x10 6-1x10 8 TU / мл.
- Медленно снять стекло микропипетки, шовный кожи на черепе, и поместите курсор мыши над грелку для более быстрого восстановления. Когда мышь просыпается после операции, управление анальгетик (ketaprofen 10 мг / кг, SC, 1 инъекция в день в течение 3 дней после операции).
2. Подготовка Острый Ломтики
- Следующие решения, необходимые для подготовки острой ломтиков: а) искусственное спинномозговой жидкости (ACSF) на основе сахарозы решение, именуемое в дальнейшем резки решение, где NaCl заменить сахарозу, чтобы ослабить увеличился возбудимости нейронов во время процедуры подготовки ломтик, и б) ACSF содержащей NaCl, нагревают до 32 ° С на водяной бане, в которую кусочки передаются и сохраняются до визуализации.
- Решения содержать следующие (в мМ): резка решение: 210.3 сахарозы, 3 KCI, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 глюкозы; ACSF: 125 NaCl, KCl, 3, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 CACI 2 x2h 2 O, 26 3 NaHCO, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 глюкозу. Поддерживать решений при рН 7.3-7.4, и постоянно кислородсодержащих путем пропускания их с 95% O 2/5% CO 2.
- Anesthetize мыши с внутрибрюшинного введения кетамина / ксилазина. Подготовка ледяной решение резки с желеобразной внешнего вида с помощью жидкого азота. Заливать мыши intracardiacaly с этим решение с использованием 20-см шприц.
- Эта процедура должна выполняться быстро, как правило, 1-2 мин на 20 мл раствора. Если кровеносные сосуды должны быть помечены, вместо того, чтобы перфузии с режущим решение, вводить transcardiacally 200 мкл Декстран Texas Red (10 мг / мл) в левый желудочек сердца и подождите 2-3 мин до обезглавливания мыши.
- Обезглавьте мУз, и быстро погрузить голову в ледяную резки решение. Используйте ножницы, чтобы удалить кожу головы, а также сокращение черепа от задней к передней оси вдоль середины сагиттальной шов от мозжечка к ОВ. Аккуратно удалите черепно закрылками с помощью пинцета.
- Акцизный хвостовой части мозга с помощью скальпеля. Вырезать мозга по внутриполушарной трещина, и сделать два сагиттальных разрезов на самой боковой части каждого полушария (рис. 1А). Аккуратно удалите мозга с помощью шпателя, и поместить его в ледяной решение резки.
- Поместите два полушария отдельно на 4% агар блок с дорсальной стороны касаясь агар, и клей блок с двумя полушариями на платформе vibratome. Клей боков вырезать стороне полушария на платформу, сохранив медиальной стороны вверх (рис. 1б). Поместите платформу в камеру vibratome и заполнить его с режущими решение. Хранить раствор кислородом во всем SLIсе подготовки путем пропускания ее с 95% O 2/5% CO 2.
- Подготовьте 250 мкм срезы толщиной использованием vibratome. Мы используем Microm HM 650 V vibratome (Thermo Scientific) и нарезать ломтиками на частоте 100 Гц и скоростью 1 мм / сек. Низкая скорость резки и высокой вибрации лезвие частота должна быть использована для получения высокого качества разделов. Как только кусочек освобождается от лезвия, осторожно удалите его из режущей решение и поместить его в инкубационной камере, наполненной кислородом ACSF поддерживается на уровне 32 ° С на водяной бане (рис. 1С).
Эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы обеспечить наилучшее качество ломтиками.
3. Покадровый Визуализация нейробластов миграции
Визуализации миграции нейробластов должна быть выполнена в течение 6-8 часов подготовки ломтиками и 3-10 дней после маркировки нейробластов. Чтобы избежать изменения параметров миграциипотому что стереотаксической инъекции, которые могут вызвать повреждение мозга и глиальных активации использования тонкой наконечником стекла микроэлектродов (1-2 мкм), чтобы свести к минимуму повреждения головного мозга, а также выполнять изображений в регионах дистальнее места инъекции (например, изображений в следующих RMS инъекции в SVZ или в RMS из обонятельной луковицы после инъекции в RMS). Хотя процедура может быть проведена до 21 дней после инъекции лентивирусные частиц в SVZ, мы рекомендуем короче после инъекции интервала (3-10 дней), поскольку она позволяет визуализировать и отслеживать больше клеток в поле зрения.
Мы использовали широкие поля флуоресцентного микроскопа моторизованными BX61WI (Olympus) оснащены CCD камера (CoolSnapHQ2, Фотометрия) и 40X цель погружением в воду с числовой апертурой 0,8 (Olympus). Цели с более высокой НС обеспечит лучшее разрешение изображений. Маркированный нейробластов (привитые или от мышей-доноров репортер или вирусно помечены) возбуждалисьс лямбда-DG-4 оснащен 175 Вт ксеноновая лампа (Sutter Instruments) на 30-100 мс на приобретение г. Multi-длина волны изображений можно проводить с использованием соответствующих наборов фильтров (Chroma) для отслеживания миграции нейронов вдоль других клеточных элементов RMS, такие как флуоресцентно меченые астроциты или кровеносных сосудов. Микроскопа, CCD камеры и DG-4 находятся под контролем MetaMorph программного обеспечения (Molecular Device), что позволило различных параметров замедленной приобретения программы, которая будет установлена (см. ниже). Ломтики были переданы PH1 серии 20 ультра-тихий изображения камеры (Harvard Apparatus), построенный на микроскопе. Камера была подключена к автоматической системе отопления (TC-344B, Harvard Apparatus) и непрерывно перфузии с кислородом ACSF (рис. 1D). Температура в камере поддерживается на уровне 31-33 ° С, а скорость потока ACSF было 1-2 мл в минуту.
- Аккуратно положите кусочек изображения в камере микроскопа. КВо избежание дрейфа среза во время съемки, стабилизировать его, осторожно поместив нейлоновая сетка (Warner Instruments) на верхней части среза. Сетка составляет 0,12 мм и отверстий от 0,3 до 1,13 мм. Установите сетку так, чтобы он не мешал поле изображения (рис. 1D). Используйте 10X цель, чтобы найти области интересов, а затем заниматься 40X объективных и фокусировки.
- Убедитесь, что срез постоянно перфузию ACSF и что есть достаточно решения между объективным и срез. Изменения в скорости ACSF перфузии, нерегулярные перфузии, или резкое изменение температуры вызывает дрейф и изменений в фокальной плоскости во время съемки.
- Установить покадровой приобретение параметров (т.е. длительность возбуждения, число плоскостей г, расстояние между Z-секции, временной интервал и продолжительность записи) с помощью программного обеспечения MetaMorph, который управляет системой сбора и начать времени недействительной приобретения. Daта автоматически сохраняется MetaMorph как TIFF файлы с каждого файла, соответствующего одному момент времени приобретенных покадровой видео.
- Выполните изображений по крайней мере 1-2 часа и принимать во внимание миграционные фаз, которые были прерваны на два стационарных фаз. Такая операция может выполняться до 4 часов (мы не выполняют изображений сессий продолжительностью более 4 часов) без каких-либо изменений в миграционных свойств нейробластов. Не клеток изображение на поверхность среза. Мы обычно изображение на глубине от 20 до 100 мкм. Мы рекомендуем использовать короткие промежутки времени приобретения (15 - 30 сек), чтобы достоверно определить начало и конец стационарных и миграции фазы.
- Для оценки участия специфических молекулярных факторов в миграции нейронов прекурсоров, нормальные ACSF может быть заменен ACSF содержащие любую фармакологических агентов (например, различные агонисты, антагонисты, блокаторы, факторы роста и др.). Выполните изображений по крайней мере,1 час в контрольных условиях, а затем в течение 1 ч в присутствии фармакологических агентов.
4. Анализ миграции нейробластов
Мы используем Imaris программного обеспечения (Bitplane) для анализа данных. Это позволяет автоматически отслеживать миграцию клеток новорожденных в 3D. Imaris 7.0F1 пакет включает в себя MeasurementsPro, Imaris слежения, ImarisColoc, ImarisXT, нити Tracer, и InPress модулей.
- Чтобы открыть фильм в Imaris, загрузите приобретенные изображения (TIFF файлы), просто перетащив изображение первой момент времени видео на иконке программы.
- Как только фильм будет загружен, настроить яркость и контрастность сигнала в окне настройки дисплея, и установить параметры приобретенного видео (размер воксела и интервал времени) в Свойства и установка эквидистантные временные точки окна (рис. 4А) . После указания размера воксела, можно увидеть кадры в 3D, а также время и масштабывидео.
- Для автоматического трек, записанный клеток, создать место для каждой ячейки в поле в Surpass окно, выбрав Места функцию. Следуйте инструкциям, и установить параметры на основе отображаемого объекта (рис. 4В). Одним из параметров является диаметр ячейки, которая может быть измерена в срез окна.
- Проверьте надежность обнаруженных объектов с течением времени. Если все мигрирующие клетки не были обнаружены автоматически, изменить порог обнаружения (рис. 4б), и убедитесь, что все клетки были выбраны с пятнами во все моменты времени.
- Во время автоматического слежения, если два объекта из соседних временных точках есть перекрытия между их границ / краев, трек подключение будет выполнено для каждого перекрытия. Максимальное расстояние и максимальная величина зазора (рис. 4в) между двумя точками представляющих соседние моменты времени одного и того же трека должны быть определены таким образом, что программа может подключиться время ПуанкареTS. Максимальное расстояние определяется расстоянием между тот же объект в последующие моменты времени.
- Как только треки сделаны, можно фильтровать треки и удалять ненужные треки, просто удалив их (рис. 4в). Треки могут быть исправлены путем подключения и отключения различных треков и различные моменты времени одного и того же трека (рис. 4в).
- После того как все корректировки были сделаны, принять окончательное взгляд на треки и экспортировать данные (ячейка смещение в момент времени, отслеживать длину, водоизмещение длина, продолжительность трека и т.д.) в файле Excel (рис. 4D).
5. Представитель Результаты
Мы протестирована и оптимизирована широким полем покадровой визуализации нейробластов миграции. Вирусный маркировки или прививки флуоресцентно меченных нейробластов в SVZ позволило надежные выражения GFP в мигрирующих клетках (рис. 2). Multi-длина волны изображений может бэлектронной применяться для визуализации нейробластов миграции вдоль других клеточных элементов RMS, такие как декстран TexasRed заполненные сосуды 4 (рис. 3 и Movie 1), астроциты флуоресцентной меткой стереотаксической инъекции вирусов с глиальных клеток промотора (рис. 2В) 12, или специально помечены астроцитов в трансгенных животных.
Широкое поле видео-изображений нейробластов миграции в острых кусочков показало, скачкообразное поведение миграцию нейрональных предшественников, состоящий из двух этапов: перемещение тела клетки нейрона к ведущим процессом, разделенных стационарной фазы (рис. 3, Фильмы 1 и 2) . Чтобы надежно определить длительность стационарного и миграционной фазы и для получения других параметров миграции клеток, такие как скорость перемещения (рассчитывается только во время миграции фазы), визуализация была выполнена в 3D с использованием короткий промежуток времени приобретения (один раз за 15 или 30 сек). Точное определение длительности стационарного и миграции фаз имеет решающее значение для однозначной интерпретации данных. Например, различие в расстоянии миграции в течение данного периода времени могут быть вызваны либо изменения в скорости миграции или изменения в продолжительности или периодичности миграции и стационарной фазы. Эти различные возможности не могут быть отделены с помощью длинных интервалах приобретения.
Imaris программное обеспечение было использовано для анализа миграции нейробластов в 3D, и для получения дополнительных параметров миграции клеток, такие как длительность путь и путевое длины, а также отслеживать перемещение длины, которая является вектор смещения. Трек прямолинейность может быть также рассчитывается путем деления длины трека длиной смещения трек, и это указывает на прямолинейность маршрута миграции отдельных нейробластов.
/ 4061/4061fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Схематическое изображение подготовке острый живой ломтиками.) Схематическое представление одного хвостовой, один внутриполушарной и два сагиттальных разрезов. Б) Схематическое изображение размещении мозга мыши на блоке агар и платформы vibratome. C) Схематическое представление острой камере инкубации срез. D) Схематическое изображение изображения камера построена на прямой микроскоп.
Рисунок 2. Маркировка нейробластов в RMS.) Низкая увеличенное изображение показывает надежной маркировки нейробластов и кровеносных сосудов у взрослого RMS. GFP ретровирус, кодирование был введен в SVZ, и GFP-экспрессирующих клеток (зеленые) были обнаружены в RMS через 3 дня (на левой панели). Кровеносные сосуды были помечены путем введения декстрана TexasRed в сердце мыши (красная, правая панель). На вставке показана высокая MagnificATION изображения кровеносных сосудов и вирусно помечены нейробластов, связанные с кровеносными сосудами. B) Маркировка различных клеточных элементов во взрослом RMS. Нейробластов были помечены путем введения mCherry кодирования лентивирус в SVZ (красный), астроциты были помечены путем введения GFP лентивирусов кодирования под контролем промотора GFAP в RMS (зеленый), и кровеносные сосуды были помечены путем введения декстрана CascadeBlue (синий ) в сердце. C) Схематическое изображение инъекции GAD67-GFP клетки отделены от SVZ из GAD67-GFP мыши в SVZ для взрослых дикого типа мышь. D) Пересаживают GAD67-GFP клетки (зеленый) обнаружена в RMS 7 дней после прививки в SVZ. RMS это иммуноокрашиванию с GFAP (синий). E) Пересаживают GAD67-GFP клеток (зеленые) были иммунопозитивных для Dcx (красный), но были immunonegative для GFAP (синий). Нажмите, чтобы увеличить цифру.
Рисунок 3. Время изображений в заданный промежуток нейробластов. Замедленной съемке нейробластов (зеленый) миграцию по кровеносным сосудам (красный). Стрелки указывают миграции фазы нейробластов, а стрелки указывают на стационарном этапах.
Рисунок 4. Анализ нейробластов миграции. (AD) различные этапы анализа миграции нейробластов. Красные круги указывают на различные функции, упомянутые в тексте. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Видео 1. Замедленной съемке вирусно помечены нейробластов (зеленый), мигрирующих по декстрана TexasRed помечены кровеносных сосудов (красный). Cлизать здесь, чтобы просмотреть видео.
Видео 2. Нейробластов отслеживания миграции программного обеспечения Imaris. Зеленые точки указывают клеточных тел и дорожек указать расстояние миграции. Щелкните здесь для просмотра видео .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Правильный нападения на нейрональных предшественников в соответствующие области мозга является одним из основных процессов, лежащих в основе правильной сборки и функции нервной системы. Подавляющее большинство клетки мигрируют в период эмбрионального развития и в послеродовом мозга лишь в нескольких регионах, таких как Обь, зубчатой извилины и мозжечка, нейронные смещения по-прежнему имеет место. Механизмы оркестровки миграции клеток в постнатальном мозге остаются, однако, мало изучены. Знание механизмов и молекулярных путей, участвующих в руководстве миграции клеток в зрелые нервные ткани улучшит наше понимание нейронов таргетинга в постнатальном мозге и может иметь клиническое значение для разработки новых стратегий, чтобы побудить нейронов призыва в больные участки мозга.
В этой рукописи мы опишем протокол для мониторинга миграции клеток при острых кусочков мозга взрослой мыши. В то время как мы использовали взрослые SVZ-OBпуть в качестве модельной системы, тот же метод может быть применен следовать миграции клеток в эмбриональном и раннем постнатальном мозге, а также в головном мозге после травмы. Мы использовали этот протокол следовать миграции клеток в раннем послеродовом RMS 12, мозжечка и взрослых после инсульта стриатуме (Eiriz, класс, Мальва и Сагателян, неопубликованные данные).
Визуализация нейробластов миграция осуществляется с помощью острого живой кусочки, которые позволяют миграцию клеток должны быть изучены в микросреде, что точно имитирует в естественных условиях. Миграция клеток были визуализированы либо путем стереотаксической инъекции вирусных частиц или путем прививки нейробластов от репортера мышей в SVZ из мышей дикого типа. Миграция анализ был проведен далеко от места инъекции. Для изучения тангенциальной миграции в RMS, мы подготовили острой ломтиками 3-5 дней после нейробластов были помечены. Для изучения радиальной миграции в OB, ломтики готовы через 7-10 дней после стеreotaxic инъекции в SVZ. Вирусные нападения на нейрональных предшественников во взрослой SVZ также может быть использована для изучения и модулировать факторов, участвующих в процессе миграции на положительной регуляции или downregulating специфических молекулярных сигналов. Кроме того, можно маркировать различные типы клеток в RMS и выполнять несколько длин волн изображение, чтобы разгадать характер миграции нейробластов по трассирующими заполненные сосуды 4, 13 или по вирусной или генетически меченых астроциты 2, 12.
Чтобы создать образ миграции нейробластов мы использовали моторизованных флуоресценции прямой микроскоп оснащен ПЗС-камеры, что позволило относительно быстрого приобретения в разных плоскостях г после коротких импульсов (30-100 мс) возбуждающего света. Это помешало фотообесцвечивания и снижение интервала времени между двумя последующими приобретениями, не вмешиваясь в 3D визуализация нейробластов миграции. Другие группы используют конфокальный или двух-фотонного микроскопа для контроля ячейки эмигрантовATION в послеродовом RMS 14-16. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки, которые в основном связаны с временным и пространственным разрешением вопросов. Мы рекомендуем использовать короткие промежутки времени (15-30 сек) между последовательными приобретений. Новорожденные нейроны имеют скачкообразное поведение и миграцию фазы прерываются стационарных периодов, которые могут быть максимально кратким, 4-10 мин 4. С учетом данного типа миграции, важно использовать относительно быстрое приобретение интервалами (15-30 сек) между соседними точками время, чтобы надежно идентифицировать начало и конец миграции и стационарной фазы. Это трудно достичь, если интервал времени между двумя последовательными приобретения находится в диапазоне от нескольких минут. Точное определение стационарной фазы и миграции требуется однозначно определить скорость нейробластов миграции, которая должна быть определена количественно только во время миграции фазы 4, 17. Большие интервалы между приобретением позволяет рассчитать усредненияэлектронной скорость, расстояние, пройденное за определенный период времени, который также включает в себя стационарные фазы. Изменения в средней скорости, заданной с помощью этого метода, однако, может быть вызвано либо различий в скорости миграции (определяется только во время миграции фаз) или на продолжительность стационарного и миграции фазы. Эти различия в приобретении параметров, скорее всего, лежат в основе различий в скоростях миграции нейробластов сообщил разных групп. Выполняя быстрое приобретение с интервалом 15-30 секунд и определения скорости миграции исключительно во время миграции фазы, мы рассчитали скорость миграции 120-150 мкм / 4 ч., 12, в то время как другие группы, которые используют приобретение интервал 3-7 мин сообщили скоростью 50-100 мкм / 14 ч, 15, 18. Основным недостатком широкого поля флуоресцентные изображения с ПЗС-камер является то, что оно обеспечивает пространственное разрешение ниже, чем сканирование системы. Однако, поскольку мигрирующих нейробластов имеют компактный Morphology с сомой и короткие ведущих процессов, ниже пространственное разрешение не исключает надежной идентификации и отслеживания нейробластов на уровне клеточных тел и даже ведущих процессов (рис. 3, Видео 1 и 2).
Техника мы описываем здесь позволяет нейробластов миграции в микросреде тесно подражая в естественных условиях, которые будут проанализированы, взаимодействие между различными компонентами RMS должны быть изучены, и роль этих взаимодействий в нейробластов миграции для изучения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR) грант ASJK была частично поддержана общение Université Laval. AS является получателем Канада заведующая кафедрой в послеродовом нейрогенеза.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
