Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.
Abstract
Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Beweisen dafür, dass neue funktionelle Neuronen konstitutiv sind von einem endogenen Pool von neuralen Stammzellen in eingeschränkten Bereichen der erwachsenen Gehirn von Säugetieren erzeugt. Newborn Neuroblasten aus der subventrikulären Zone (SVZ) wandern entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) an ihren endgültigen Bestimmungsort im Riechkolben (OB) 1. In der RMS, Neuroblasten tangential migrieren in Ketten von 2,3 Astrozytenfortsätze Verwendung Blutgefäße als strukturelle Unterstützung und eine Quelle für molekularen Faktoren für die Migration 4,5 erforderlich umhüllt. In der OB, Neuroblasten von den Ketten lösen sich und wandern radial in den verschiedenen bulbären Lagen, wo sie differenzieren sich in Interneuronen und Integration in das bestehende Netzwerk 1, 6.
In diesem Manuskript beschreiben wir das Verfahren für die Überwachung der Zellwanderung in akuten Schnitten des Nagergehirn. Die Verwendung von akuten Scheiben ermöglicht die assessment der Zellwanderung in der Mikroumgebung, dass sehr ähnlich in vivo Bedingungen und in Hirnregionen, die schwer zu in-vivo-Bildgebung zugänglich sind. Darüber hinaus vermeidet es lange Kultivierung Bedingung wie im Fall von organotypischen und Zellkulturen, die schließlich verändern kann die Migrations-Eigenschaften der Zellen. Neuronalen Vorläuferzellen in akuten Scheiben können visualisiert werden unter Verwendung von DIC Optik oder fluoreszierende Proteine. Virale Etikettierung von neuronalen Vorläufern in dem SVZ, Pfropfung Neuroblasten aus Reporter-Mäuse in der SVZ von Wildtyp-Mäusen, und unter Verwendung von transgenen Mäusen, die fluoreszierende Protein exprimieren in Neuroblasten sind alle geeignete Methoden zur Visualisierung Neuroblasten und nach ihrer Migration. Die spätere Verfahren ist jedoch nicht möglich einzelne Zellen über lange Zeiträume aufgrund der hohen Dichte von markierter Zellen verfolgt werden. Wir verwendeten eine Weitfeld-fluoreszierenden aufrechtes Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, um eine relativ schnelle Erfassungsintervall (eine ima erreichenge alle 15 oder 30 Sek.), um sicher zu identifizieren die stationäre und wandernde Phasen. Eine genaue Identifizierung der Dauer der stationären und wandernden Phasen ist entscheidend für die eindeutige Interpretation der Ergebnisse. Wir führten auch mehrere z-Schritt Akquisitionen Neuroblasten Migration in 3D zu überwachen. Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung wurde ausgiebig zu visualisieren neuronalen Migration 7-10 verwendet. Hier beschreiben wir detailliertes Protokoll zur Beschriftung Neuroblasten, Durchführung Echtzeit-Video-Bildgebung Neuroblast Migration in akuten Schnitten des adulten Maus Vorderhirn und Analyse Zellmigration. Während die beschriebene Protokoll die Migration von Neuroblasten im adulten RMS veranschaulicht, kann es auch verwendet werden, um die Zellmigration in embryonalen und frühen postnatalen Gehirn folgen.
Protocol
Ein. Kennzeichnung neuronalen Vorläuferzellen
Neuroblasten visualisiert werden mit transgenen Mäusen, die selektiv auszudrücken fluoreszierende Proteine in Neuroblasten (dh Dcx-GFP, Gad67-GFP), gefolgt von stereotaktisch Injektion Viruspartikeln kodiert fluoreszierende Proteine in die SVZ-oder RMS, oder durch Pfropfen neuronalen Vorläuferzellen von Reporter Mäusen (dh , Dcx-GFP, Gad67-GFP) in der SVZ von Wildtyp-Mäusen. Wir beschreiben das Verfahren zur Veredelung und virale Kennzeichnung von neuronalen Vorläuferzellen.
Dissoziation von Neuroblasten aus der SVZ von Reporter Mäusen
- Die folgenden Lösungen sind für Neuroblast Dissoziation erforderlich.
40X-Lösung
10 ml Pen / Strept (Stock Pen 10.000 u / ml / Strept 1.000 ug / ml)
10 ml Glucose (Stock 200 mg / ml)
20 ml Natriumpyruvat (Stock 100 mM)
ove_content "> 10 ml H 2 OPlanen 1 ml Aliquots
Dissektion Lösung (100 ml)
HBSS 1X - 97,4 ml
HEPES (1 M) - 0,1 ml
40X-Lösung - 2,5 ml
DNase-Lösung (20K Einheiten / ml)
DNaseI, TypIV aus Rinderpankreas
150.000 Einheiten in 7,5 ml H 2 O lösen
Gefilterte 0,22 um
Planen 1 ml Aliquots
Trypsin-DNaseI-Lösung (10 ml)
HBSS - 8,6 ml
DNaseI (20K Einheiten / ml) - 0,15 ml
Trypsin-EDTA (0,5%) - 1 ml
40X-Lösung - 0,25 ml
Verreiben Lösung (50 ml)
ntent "> Neurobasalmedium - 47,5 mlBSA (300 mg / ml) - 332,5 ul
40X-Lösung - 1,25 ml
DNaseI (20K Einheiten / ml) - 0,66 ml
- Anesthetize zwei bis drei Monate alten erwachsenen Maus Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins in Neuroblasten mit einer intraperitonealen Injektion von 100 ul Ketamin / Xylazin (10 mg / 1 mg pro 10 g Körpergewicht), dann enthaupten. Wir verwenden GAD67-GFP Mäusen 11. Mit dem Skalpell schneiden das Gehirn koronal auf der Ebene der Seitenventrikel und sezieren das SVZ in eiskaltem Dissektion Medium. Legen Sie die SVZ in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 ul Trypsin-DNase-Lösung, und auf Eis für 20 min.
- Übertragen Sie die SVZ in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml vorgewärmtes (37 ° C) Trypsin-DNase-Lösung und bei 37 ° C in einer 5% CO 2 für 30 min.
- Den gesamten Inhalt in einem 50 ml konischen Röhrchen mit 15 ml tritration Lösung und Zentrifuge bei 1.000 xg für 1 min. Überstand, 10 ml Verreibung Lösung, übertragen die Zellen zu einem neuen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren bei 1000 xg für 1 min.
- Fire-polieren einer Pasteurpipette, um die Spitze Größe und Mantel mit Verreibung Medium zu reduzieren. Nach Zentrifugation zu entfernen, da ein Großteil der Überstand wie möglich, und 2 ml von frischem Verreibung Lösung des konischen Rohrs. Verreiben die Zellen in der Verreibung Lösung (etwa 50-mal rauf und runter mit Pasteurpipette). Nehmen Sie die obere Hälfte der Überstand, der auch dissoziierten Zellen enthält, und übertragen Sie sie in ein neues 15 ml konischen Röhrchen mit 10 ml Verreibung Lösung.
- Feuer-Politur eine Pasteurpipette zur weiteren Reduzierung der Größe der Spitze. Hinzufügen 1 ml Verreibung Lösung für das Röhrchen mit den verbleibenden undissoziierten Zellen, weiterhin die Verreibung (etwa 10 mal rauf und runter), und den kompletten Inhalt der 15 ml konischen Röhrchen containing bislang getrennten Zellen. Zentrifuge bei 1.000 xg für 7 min. Überstand verwerfen, resuspendieren die pelletierten Zellen in 50 ml Neurobasalmedium, Last in einer Zählkammer, und zählen Sie die Zellen.
Pfropf die gewünschte Anzahl von Zellen in der SVZ Verwendung des unten beschriebenen Verfahrens.
Stereotaktische Injektion des Virus und Aufpfropfen von dissoziierten Zellen
- Sterilisieren alle Instrumente mit einem Wulst Sterilisator vor Beginn der Operation.
- Für stereotaktischen Injektionen, verwenden Glasmikropipetten mit sehr dünnen Spitzen (1-2 um) um Hirnschäden minimieren. Um eine Pipette zu machen, ziehen Sie eine Glaskapillare mit einer Pipette abziehen. Backfill die Pipette mit Paraffinöl bis halb voll, und legen Sie den Kolben eines Nanoliter Injektor (World Precision Instruments) in den unbehandelten Ende der Pipette.
- Mit einem Nanoliter Injektor-Controller, zwingen die Öl nach unten mit dem Kolben, bis ein kleines drop Paraffinöl extrudiert aus der dünnen Spitze. Senken der Pipette in ein steriles Gefäß mit 0,5-1 ul einer Lösung, die entweder Viruspartikeln (1x10 6-1x10 8 TU / ml) oder dissoziiert SVZ Zellen. Verwenden Sie den Rücktritt Funktion des Nanoliter Injektor, um die Pipette mit der gewünschten Lösung zu füllen. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der Pipette.
- Anesthetize zwei bis drei Monate alten erwachsenen C57BL / 6 Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um die chirurgische Stelle auf dem Kopf zu rasieren. Reinigen Sie auch mit nassen Gaze anhaftendem Haare zu entfernen.
- Platzieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen und fixieren den Kopf. Waschen Sie das Haar-free Injektionsstelle mit einem Desinfektionsmittel Seife (Hibitane) und dann mit 70% Alkohol (Gaze oder Spray). Desinfizieren der Site mit Proviodine (Gaze oder Spray) und decken das Tier mit einem Operationsfeld.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in der sterilisierten Haut der Maus, und sorgfältig verteilt die Haut zu entlarvendie zugrunde liegenden Schädel. Trocknen Sie die Oberfläche des Schädels. Verwenden des Bregma und Mittellinie als Null-Koordinaten, um die anterio-posterior (AP) und mediolateralen (ML) stereotaktischen Koordinaten festgelegt sind.
- Bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel über jede Hemisphäre bei den entsprechenden Koordinaten. Vermeiden Sie Beschädigungen des zugrunde liegenden Hirngewebe. Bohren Sie vorsichtig, bis nur noch die Knochen verletzt wurde. Reinigen Sie die Öffnung und den Null-Koordinaten für die dorso-ventralen (DV) stereotaktischen Koordinaten auf der Oberfläche des Gehirns. Wir verwenden folgende Koordinaten (in mm) für Injektionen in der SVZ oder RMS von erwachsenen (22-24 g) C57Bl / 6 Mäuse: SVZ: AP 0,70, ML 1,20 und DV 1,90, für RMS: AP 2,55, ML 0,82 und DV 3.15.
- Langsam einzuführen Glas Mikropipettenspitze in das Gehirn über die entsprechenden Koordinaten DV als Führungen, und langsam zu injizieren eine kleine Menge (100 bis 500 nl injizieren wir bei 5 nl / sec) der Zellsuspension (dissoziiert vom SVZ von Reporter-Mäuse) oder ein Lösung, die viralen Partikel. Wir verwenden normalerweiselentivirale oder retrovirale Partikel 1x10 6-1x10 8 TU / ml.
- Ziehen Sie langsam das Glas Mikropipette, nähen die Haut über dem Schädel, und platzieren Sie den Mauszeiger auf einem Heizkissen für eine schnellere Genesung. Wenn die Maus aufwacht nach der Operation, Administration ein Analgetikum (ketaprofen 10 mg / kg, SC, 1 Injektion pro Tag während 3 Tagen post-op).
2. Vorbereiten Akute Slices
- Die folgenden Lösungen sind erforderlich, um akute Scheiben herzustellen: a) ein künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Saccharose-basierte Lösung, nachstehend Schneidlösung, wobei NaCl durch Saccharose ersetzt wird, um erhöhte neuronale Erregbarkeit während der Herstellungsprozedur Scheibe dämpfen, und b) ACSF enthaltend NaCl, erwärmt auf 32 ° C in einem Wasserbad, in welche die Scheiben übertragen und bis Bildgebung aufrechterhalten.
- Die Lösungen enthalten die folgenden (in mM): Schneiden Lösung: 210,3 Saccharose, 3 KCI, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 CaCl 2 2 O 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 Glucose; ACSF: 125 NaCl, 3 KCl, 1,3 MgCl 2 x6H 2 O, 2 CaCl 2 × 2H 2 O, 26 NaHCO 3, 1,25 NaH 2 PO 4, 20 Glucose. Pflegen Sie die Lösungen bei einem pH-Wert von 7,3-7,4, und ständig Sauerstoff durch Einblasen von ihnen mit 95% O 2/5% CO 2.
- Anesthetize die Maus mit einer intraperitonealen Gabe von Ketamin / Xylazin. Bereiten eiskalten Schneiden Lösung mit einer gelartigen Aussehen mit flüssigem Stickstoff. Perfundieren die Maus intracardiacaly mit dieser Lösung mit einem 20-ml-Spritze.
- Dieses Verfahren sollte schnell durchgeführt werden, üblicherweise 1-2 min für 20 ml Lösung. Wenn die Blutgefäße zu etikettierenden statt Perfundieren mit dem Schneiden Lösung werden müssen, injizieren transcardiacally 200 ul Texasrot Dextran (10 mg / ml) in den linken Ventrikel des Herzens, und warten 2-3 min vor decapitating der Maus.
- Enthaupten die mouse und schnell tauchen den Kopf in eiskaltem Schneiden Lösung. Verwenden Sie die Schere, um die Kopfhaut zu entfernen, und schneiden Sie den Schädel von der hinteren zur vorderen Achse entlang der Mitte sagital Nahtmaterial aus dem Kleinhirn der OB. Entfernen Sie vorsichtig die Schädelbasis Klappen mit einer Pinzette.
- Excise der kaudale Teil des Gehirns mit einem Skalpell. Schneiden Sie das Gehirn entlang der intrahemisphärische Riss, und machen Sie zwei sagittale Schnitte auf der die meisten seitlichen Teil jeder Hemisphäre (Abbildung 1A). Entfernen Sie vorsichtig das Gehirn mit einem Spatel, und legen Sie sie in eiskaltem Schneiden Lösung.
- Platzieren Sie die zwei Hemisphären separat auf einem 4% Agar-Block mit der Rückenseite Berühren der Agar und Leim der Block mit den zwei Halbkugeln an der Plattform eines Vibratom. Kleben Sie die seitlich geschnitten Seite der Hemisphäre auf die Plattform, halten medialen Seite nach oben (Abbildung 1B). Legen Sie die Plattform in der Kammer des Vibratom und füllen Sie es mit schneidender Lösung. Halten Sie die Lösung in der sli Sauerstoffce Vorbereitung durch Einblasen mit 95% O 2/5% CO 2.
- Bereiten 250 um dicke Schnitte mit der Vibratom. Wir verwenden eine Microm HM 650 V Vibratom (Thermo Scientific) und die Scheiben mit einer Frequenz von 100 Hz und einer Geschwindigkeit von 1 mm / sec. Eine niedrige Schnittgeschwindigkeit und hoher Frequenz Schaufelschwingung sollte verwendet werden, um qualitativ hochwertige Teile zu erhalten. Sobald ein Stück von der Klinge wird freigegeben, entfernen Sie sie aus dem Schneiden Lösung und legen Sie sie in einem Brutschrank mit sauerstoffreichem ACSF bei 32 ° C in einem Wasserbad (1C) gehalten gefüllt.
Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um die beste Qualität Scheiben zu gewährleisten.
3. Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration
Die Bildgebung von wandernden Neuroblasten sollte innerhalb von 6-8 h der Herstellung von Scheiben und 3-10 Tage nach Neuroblasten Kennzeichnung durchgeführt werden. Um Änderungen in der Migration Parameter zu vermeidenweil stereotaktische Injektion, die Hirnschäden und Glia-Aktivierung Verwendung dünner Spitze Glasmikroelektroden (1-2 um) zu induzieren könnte, um das Gehirn zu minimieren, und führen Sie die Bildgebung in den Regionen fern von der Injektionsstelle (dh Bild in der RMS folgenden Injektion in die SVZ oder in der RMS der Riechkolben nach der Injektion in die RMS). Obwohl die Bildgebung kann bis zu 21 Tage nach der Injektion durchgeführt werden lentiviraler Partikel in die SVZ empfehlen wir kürzere Nacheinspritzung Intervall (3-10 Tage), da es die Visualisierung und Verfolgen mehr Zellen pro Sichtfeld ermöglicht.
Wir verwendeten eine Weitfeld-fluoreszierenden motorisierten BX61WI Mikroskop (Olympus) mit einem CCD-Kamera (CoolSnapHQ2, Photometrics) und einem 40X Wasserlagerung Objektiv mit einer numerischen Apertur 0,8 (Olympus) ausgestattet. Die Ziele mit höherer NA wird eine bessere Auflösung. Labeled Neuroblasten (gepfropft entweder von einem Reporter Donor-Maus oder viral beschriftet) waren begeistertmit einem Lambda DG-4 mit einer 175 W Xenon-Lampe (Sutter Instruments) für 30-100 ms pro z Übernahme ausgestattet. Multiwellenlängen-Bildgebung kann auch durchgeführt werden unter Verwendung geeigneter Filtersätze (Chroma) an neuronaler Migration entlang den anderen zellulären Elemente des RMS, wie fluoreszenzmarkierten Astrozyten oder Blutgefäße zu verfolgen. Das Mikroskop, CCD-Kamera und DG-4 wurden durch MetaMorph Software (Molecular Device), die die verschiedenen Parameter der Zeitraffer-Akquisitions-Programm auf (siehe unten) dürfen gesteuert. Die Scheiben wurden auf eine PH1 Serie 20 ultraleise Abbildungskammer (Harvard Apparatus) auf dem Mikroskop eingebaut übertragen. Die Kammer wurde auf einem automatischen Heizsystem (TC-344B, Harvard Apparatus) verbunden und wurde kontinuierlich mit Sauerstoff angereicherten ACSF (1D) perfundiert. Die Temperatur in der Kammer wurde bei 31-33 ° C gehalten wird und die Strömungsgeschwindigkeit des ACSF betrug 1-2 ml pro min.
- Legen Sie das Slice in der Bildgebung Kammer des Mikroskops. AufDriften der Scheibe zu vermeiden während der Bildgebung, stabilisieren sie durch vorsichtiges Platzieren eines Nylonsieb (Warner Instruments) auf der Oberseite der Scheibe. Die Maschenweite beträgt 0,12 mm dick und die Öffnungen Bereich von 0,3 bis 1,13 mm. Positionieren Sie das Netz, so dass sie nicht behindern Bildfeld (Abbildung 1D). Verwenden Sie einen 10X-Objektiv, um ein Feld von Interesse sind, und greifen dann die 40X-Objektiv und den Fokus einzustellen.
- Sicherstellen, dass die Scheibe kontinuierlich mit ACSF und dass genügend Lösung zwischen dem Objektiv und dem Slice perfundiert. Änderungen in der Rate der ACSF Perfusion, unregelmäßiger Durchblutung, oder drastische Temperaturschwankungen verursacht treiben und Veränderungen in der Brennebene während der Bildgebung.
- Festlegen der Zeitraffer-Erfassungsparameter (dh Dauer der Anregung, die Anzahl der Ebenen z, Abstand zwischen jeder z-Abschnitt Zeitintervall und Dauer der Aufzeichnung) unter Verwendung des MetaMorph Software, die den Erwerb System steuert und Starten des zeitlichen erlischt Akquisition. Data wird automatisch durch MetaMorph als TIFF-Dateien mit jeder Datei entspricht einem Zeitpunkt des erworbenen Zeitraffer-Video gespeichert.
- Führen Sie die Bildgebung für mindestens 1-2 Stunden und berücksichtigen wandernde Phasen, die von zwei stationären Phasen unterbrochen werden. Die Bildgebung kann durchgeführt werden bis zu 4 Stunden (die wir nicht durchführen Imaging-Sitzungen, die länger als 4 Stunden) ohne Änderungen in der Migration Eigenschaften der Neuroblasten. Nicht Bildzellen an der Oberfläche der Scheibe. Wir normalerweise Bild in einer Tiefe von 20 bis 100 um. Wir empfehlen, mit kurzen Abständen Akquisition (15 - 30 sec) zur sicheren Bestimmung von Beginn und Ende des stationären und Migration Phasen.
- Um die Beteiligung von spezifischen molekularen Faktoren bei der Migration von neuronalen Vorläufern beurteilen können normale ACSF mit ACSF mit einer beliebigen gewünschten pharmakologischen Wirkstoff (dh verschiedene Agonisten, Antagonisten Blocker, Wachstumsfaktoren, etc.) ersetzt werden. Führen Sie Imaging für mindestens1 Stunde in Steuerbedingung und dann für 1 Stunde in Gegenwart des pharmakologischen Wirkstoffs.
4. Analyse Neuroblast Migration
Wir verwenden Imaris Software (Bitplane), um die Daten zu analysieren. Dies ermöglicht es uns automatisch zu verfolgen Neugeborenen Zellwanderung in 3D. Die Imaris 7.0F1 Paket enthält die MeasurementsPro, Imaris Tracking, ImarisColoc, ImarisXT, Filament Tracer und Inpress Module.
- Um den Film in Imaris öffnen, laden Sie die aufgenommenen Bilder (TIFF-Dateien), indem Sie einfach per Drag & Drop das Bild des ersten Zeitpunkt des Videos auf das Programm-Icon.
- Sobald der Film geladen ist, passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Signals in der Einstellung des Displays Fenster, und stellen Sie die Parameter des erworbenen Video (Voxelgröße und Zeitintervall) in den Eigenschaften des Bildes und Set äquidistanten Zeitpunkten Fenster (Abb. 4A) . Nach Angabe der Voxelgröße, ist es möglich, den Rahmen in 3D sowie die Uhrzeit und das Ausmaß des Problems zu sehenVideo.
- Um automatisch aufgezeichnet Zellen, eine Stelle für jede Zelle in dem Feld in der Surpass-Fenster, indem Sie die Spots Funktion. Folgen Sie den Schritten, und stellen Sie die Parameter auf der abgebildeten Objekte (4B) basiert. Einer der Parameter der Durchmesser der Zelle, die in der Slice-Fenster gemessen werden kann.
- Untersuchen der Zuverlässigkeit der detektierten Objekte über die Zeit. Wenn alle wandernden Zellen nicht automatisch erkannt werden, ändern die Schwelle von Erkennung (4B), und stellen Sie sicher, dass alle Zellen mit Flecken wurden zu allen Zeitpunkten gewählt.
- Während der automatischen Verfolgung, wenn zwei Objekte aus dem benachbarten Zeitpunkten Überschneidungen zwischen ihren Grenzen / Kanten haben, wird eine Gleisverbindung für jede Überlappung aufweisen. Der maximale Abstand und maximale Spaltgröße (4C) zwischen zwei Punkten repräsentiert benachbarten Zeitpunkten der gleichen Spur müssen so festgelegt werden, dass das Programm die Zeit poin verbindents. Der maximale Abstand wird durch den Abstand zwischen dem gleichen Objekt am nachfolgenden Zeitpunkten bestimmt.
- Sobald die Bahnen gemacht sind, ist es möglich, um die Titel filtern und entfernen irrelevant Spuren durch einfaches Löschen (4C). Spuren können durch Verbinden und Trennen verschiedenen Strecken und verschiedenen Zeitpunkten von der gleichen Spur (4C) korrigiert werden.
- Nachdem alle Korrekturen vorgenommen wurden, nehmen einen letzten Blick auf den Gleisen und exportieren Sie die Daten (Zelle Verschiebung pro Zeitpunkt, Streckenlänge, Verschiebung Länge, Spurdauer etc.) in eine Excel-Datei (4D).
5. Repräsentative Ergebnisse
Wir getestet und optimiert wide-field Zeitraffer-Aufnahmen von Neuroblast Migration. Virale Etikettieren oder Pfropfung von fluoreszenzmarkierten Neuroblasten in die SVZ für robuste GFP-Expression in wandernden Zellen (Abbildung 2) erlaubt. Multi-Wellenlängen-Bildgebung kann be angewendet Neuroblast Migration visualisieren entlang anderen zellulären Elemente des RMS wie Dextran TexasRed gefüllten Blutgefäße 4 (Abbildung 3 und Movie 1), Astrozyten fluoreszent durch stereotaktische Injektion von Viren mit einer Gliazelle Promotor (2B) 12 bezeichnet, oder speziell Astrozyten in transgenen Tieren bezeichnet.
Weitfeld-Video-Abbildung von akutem Neuroblast Migration in Scheiben offenbarte die saltatorische Verhalten von migrierenden neuronalen Vorläuferzellen aus zwei verschiedenen Phasen besteht: Verschiebung des neuronalen Zellkörper in Richtung des führenden Prozesses durch eine stationäre Phase getrennt (Abbildung 3, Filme 1 und 2) . Die zuverlässige Identifizierung der Dauer der stationären und wandernden Phasen und zum Ableiten Zellmigration anderen Parametern wie der Geschwindigkeit der Verschiebung (nur während der Phasen der Migration berechnet), wurde in 3D Bildgebung unter Verwendung einer kurzen Erfassungsintervall (einmal pro 15 oder 30 sec). Die genaue Identifizierung der Dauer der stationären und Phasen der Migration ist entscheidend für die eindeutige Interpretation der Daten. Beispielsweise können Unterschiede im Abstand der Migration während einer bestimmten Periode entweder durch Änderungen in der Rate der Migration oder durch Änderungen in der Dauer oder Periodizität der Migration und stationäre Phasen induziert werden. Diese verschiedenen Möglichkeiten nicht zu unterscheiden mit langen Übernahme Abständen werden.
Imaris Software wurde verwendet, um die Migration von Neuroblasten in 3D analysieren und zum Ableiten weiterer Parameter der Zellwanderung wie Spur Dauer und Spurlänge sowie Spurversatz Länge, die ein Vektor der Versetzung ist. Die Strecke kann auch Geradheit durch Teilen der Länge des Titels durch die Spur Verschiebungslänge berechnet werden und es gibt die Geradheit des wandernden Strecke einzelner Neuroblast.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Herstellung von akuten Live Scheiben schneiden. A) Schematische Darstellung eines caudal, ein intrahemisphärische und zwei sagittale Schnitte. B) Schematische Darstellung der Platzierung Gehirn der Maus auf dem Agar-Block und die Plattform des Vibratom. C) Schematische Darstellung der akuten Scheibe Inkubationskammer. D) Schematische Darstellung der Abbildungskammer am aufrechten Mikroskop gebaut.
Abbildung 2. Kennzeichnung von Neuroblasten in der RMS. A) niedriger Vergrößerung Bild zeigt robuste Kennzeichnung von Neuroblasten und Blutgefäße in der erwachsenen RMS. Ein Retrovirus kodiert GFP in der SVZ injiziert und GFP-exprimierenden Zellen (Grün) wurden in der RMS nach 3 Tagen (linkes Feld) detektiert. Blutgefäße wurden durch Injektion Dextran TexasRed in das Herz der Maus (rot, rechts) beschriftet. Der Einschub zeigt eine hohe magnification Bild von Blutgefäßen und viral bezeichnet Neuroblasten mit Blutgefäßen verbunden. B) Kennzeichnung der unterschiedlichen zellulären Elemente in der erwachsenen RMS. Neuroblasten durch Einspritzen mCherry kodierenden Lentivirus in der SVZ (rot) markiert waren, wurden Astrozyten durch Einspritzen eines Lentivirus Codierung GFP unter der Kontrolle eines Promotors GFAP in der RMS (grün) bezeichnet und Blutgefäße wurden durch Injektion Dextran CascadeBlue (blau markiert ) in das Herz. C) Schematische Darstellung der Injektion von GAD67-GFP-Zellen losgelöst von der SVZ eines GAD67-GFP Maus in der SVZ eines erwachsenen Wildtyp-Maus. D) Transplantierte GAD67-GFP Zellen (grün) in der RMS 7 Tage nach Transplantation in der SVZ detektiert. Das RMS ist mit GFAP (blau) immungefärbt. E) Transplantierte GAD67-GFP-Zellen (grün) waren immunopositiv für DCX (rot), waren aber immunonegative für GFAP (blau). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Zeitraffer-Aufnahmen von Neuroblasten. Zeitraffer-Bildgebung Neuroblast (grün) Wanderung entlang Blutgefäße (rot). Die Pfeile zeigen die Phasen der Migration der Neuroblasten und die Pfeilspitzen zeigen die stationären Phasen.
Abbildung 4. Analyse Neuroblast Migration. (AD) Verschiedene Schritte Neuroblasten Migration Analyse. Die roten Kreise zeigen die verschiedenen Funktionen im Text erwähnt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Video 1. Zeitraffer-Bildgebung von viral bezeichnet Neuroblasten (grün) Migration entlang Dextran TexasRed markierten Blutgefäße (rot). Clecken Sie hier, um Video anzusehen.
Video 2. Tracking Neuroblast Migration Imaris Software. Grüne Punkte stehen für Zellkörper und Tracks geben den Abstand der Migration. Klicken Sie hier, um Video anzusehen .
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Discussion
Die korrekte Ausrichtung der neuronalen Vorläuferzellen zu den entsprechenden Hirnregionen ist ein fundamentaler Prozess zugrunde liegende ordnungsgemäße Montage und Funktion neuronaler Schaltkreise. Die überwiegende Mehrheit der Zellen während der Embryonalentwicklung wandern und in der postnatalen Gehirn nur in wenigen Regionen, wie der OB, Gyrus dentatus und Kleinhirn, neuronale Verschiebung noch stattfindet. Die Mechanismen orchestrieren Zellwanderung in der postnatalen Gehirn verbleiben jedoch nur unzureichend verstanden. Kenntnisse über die Mechanismen und molekularen Mechanismen bei der Führung der Zellwanderung in reifen Nervengewebe beteiligt verbessern unser Verständnis der neuronalen Targeting in der postnatalen Gehirn und können klinische Relevanz für die Entwicklung neuer Strategien, um neuronale Rekrutierung in erkrankten Bereiche des Gehirns induzieren.
In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Überwachung der Zellwanderung bei akuten Scheiben der adulten Maus Vorderhirn. Während wir nutzten die Erwachsenen SVZ-OBStoffwechselweg als Modellsystem, kann die gleiche Technik angewendet Zellmigration in der embryonalen und postnatalen Gehirn frühen als auch im erwachsenen Gehirn nach Verletzungen folgen. Wir haben dieses Protokoll Zellwanderung in der frühen postnatalen RMS 12, Kleinhirn und Erwachsenen nach einem Schlaganfall Striatum (Eiriz, Grade, Malva und Saghatelyan, unveröffentlichte Daten) folgen.
Imaging von Neuroblast Migration wurde mit akuten Live Scheiben, die Zellwanderung in einer Mikroumgebung, die ahmt in vivo Bedingungen untersucht werden können. Wandernden Zellen wurden entweder visualisiert durch stereotaktische Injektion von Viruspartikeln oder durch Pfropfen Neuroblasten aus Reporter-Mäuse in der SVZ von Wildtyp-Mäusen. Die Migration Analyse wurde weit von der Injektionsstelle durchgeführt. Um tangentiale Migration in der RMS studieren, haben wir akuten Scheiben 3-5 Tage nachdem die Neuroblasten markiert wurden. Zur Migration in der radialen OB zu untersuchen, wurden die Scheiben 7-10 Tage nach einem ste hergestelltreotaxic Injektion in der SVZ. Virale Targeting von neuronalen Vorläufern im adulten SVZ auch verwendet werden kann, um zu untersuchen und zu modulieren Faktoren bei der Migration von hochreguliert oder herunterreguliert spezifischen Signalstoffe beteiligt. Es ist auch möglich, verschiedene Zelltypen in der RMS beschriften und führen Multiwellenlängenlicht Bildgebung um das Muster der Neuroblasten Migration entlang Tracer gefüllten Gefäße 4, 13 oder entlang viral oder genetisch markierte Astrozyten 2, 12 entwirren.
Zur Bilder Neuroblast Migration verwendeten wir einen motorisierten Fluoreszenz aufrechtes Mikroskop mit einer CCD-Kamera, die relativ rasche Akquisitionen zu unterschiedlichen Ebenen z nach kurzer Impulse (30-100ms) von Anregungslicht gestattet ist. Dies verhinderte Photobleichen und verringerte das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Akquisitionen ohne die 3D-Visualisierung der Neuroblast Migration. Andere Gruppen haben konfokale oder Zwei-Photonen-Mikroskop verwendet, um Zellen migr überwachenation in der postnatalen RMS 14-16. Beide Techniken haben ihre Vor-und Nachteile, die vor allem die zeitliche und räumliche Auflösungen Probleme verbunden sind. Wir empfehlen die Verwendung kurzen Intervallen (15-30 sec) zwischen aufeinanderfolgenden Akquisitionen. Newborn Neuronen saltatory Verhalten und Phasen der Migration von stationären Perioden, die so kurz wie 4-10 min 4 unterbrochen. Angesichts dieser Art der Migration, ist es wichtig, relativ schnelle Akquisition Abständen (15-30 sec) zwischen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verwenden, um sicher zu identifizieren den Anfang und das Ende der Migration und der stationären Phase. Dies ist schwierig zu erreichen, wenn das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Akquisitionen liegt im Bereich von mehreren Minuten. Eine exakte Bestimmung der stationären und Migration Phasen benötigt, um eindeutig zu definieren die Geschwindigkeit Neuroblast Migration, die nur während der sollte Migrationsphasen 4, 17 quantifiziert werden. Lange Übernahme Abständen ermöglicht die Mittelwertbildung berechnene Geschwindigkeit wie die Wegstrecke über einen gewissen Zeitraum, der auch stationärer Phasen. Änderungen der durchschnittlichen Geschwindigkeit durch dieses Verfahren definierten, jedoch kann entweder durch Unterschiede in der Rate der Migration (nur während Migrationsphasen definiert) oder von der Dauer der stationären und Migration Phasen verursacht werden. Diese Unterschiede in der Aufnahme-Parameter dürften die Diskrepanzen in den Geschwindigkeiten von Neuroblasten Migration von verschiedenen Gruppen berichteten zugrunde liegen. Durch Ausführen schnellen Akquisitionen mit einer 15-30 Sekunden Intervall und Bestimmen der Rate der Migration ausschließlich während der Migrationsphasen berechneten wir eine Geschwindigkeit von Migration von 120-150 um / h 4, 12, während andere Gruppen, die ein Erfassungsintervall Benutzerfreundlichkeit 3-7 min gemeldet eine Geschwindigkeit von 50 bis 100 um / h 14, 15, 18. Der Hauptnachteil der Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit CCD-Kameras ist, dass sie niedriger räumlicher Auflösung als Abtastsysteme bereitstellt. Allerdings haben seit der Migration Neuroblasten eine kompakte Morphology mit Soma und kurze führenden Prozessen, hat eine geringere räumliche Auflösung nicht ausschließen die zuverlässige Identifizierung und Verfolgung von Neuroblasten auf der Ebene der Zellkörper und sogar führenden Prozessen (Abbildung 3 und Videos 1 und 2).
Die Technik, die wir beschreiben hier ermöglicht Neuroblast Migration in einer Mikroumgebung eng imitiert in vivo-Bedingungen analysiert werden, die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des RMS untersucht werden, und die Rollen dieser Wechselwirkungen in Neuroblast Migration untersucht werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Zuschuss zu ASJK wurde teilweise durch einen Université Laval Gemeinschaft unterstützt werden. AS ist der Empfänger einer Canada Research Chair in postnatale Neurogenese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCI | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 | |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNase I | Sigma | D-5025 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 | |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 | |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 | |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 | |
| Petri dish | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Glue | Permabond | 910 | |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 | |
| Blade | WPI | 501901 | |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 | |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 | |
| Micro drill system | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF | |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 | |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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