Nós descrevemos um protocolo em tempo real videoimaging da migração neuronal no cérebro anterior mouse. A migração de viralmente etiquetados ou enxertado precursores neuronais foi gravado em fatias agudas vivo usando largo campo de imagem fluorescente, com um intervalo de aquisição relativamente rápida para estudar as diferentes fases da migração de células, incluindo as durações das fases estacionária e de migração e da velocidade da migração.
Existe um grande conjunto de provas indica que os novos neurónios funcionais são constitutivamente gerada a partir de um pool de endógena das células estaminais neurais em áreas restritas do cérebro de mamíferos adultos. Neuroblastos-nascidos da zona subventricular (SVZ) migram ao longo do córrego migratório rostral (RMS) para seu destino final no bulbo olfatório (OB) 1. No RMS, neuroblastos migram tangencialmente em cadeias ensheathed por processos astrocíticos 2,3 utilizando vasos sanguíneos como um suporte estrutural e de uma fonte de factores moleculares necessários para a migração de 4,5. No OB, neuroblastos destacar das cadeias e migram radialmente em diferentes camadas bulbares onde se diferenciam em interneurônios e integrar a rede existente 1, 6.
Neste artigo, descreve o procedimento para a migração de células de controlo em fatias agudas do cérebro de roedores. O uso de fatias agudas permite a assessment de migração celular no microambiente que se assemelha a condições in vivo e em regiões do cérebro que são de difícil acesso por imagem in vivo. Além disso, evita-se a cultura de longo condição, como no caso de culturas organotípicas célula e que pode, eventualmente, alteram as propriedades de migração das células. Precursores neuronais em fatias agudas podem ser visualizados usando óptica DIC ou proteínas fluorescentes. Rotulagem viral de precursores neuronais no SVZ, neuroblastos enxerto de ratos repórter no SVZ de ratinhos de tipo selvagem, e utilizando ratinhos transgénicos que expressam a proteína fluorescente em neuroblastos são todos os métodos adequados para a visualização de neuroblastos e na sequência da sua migração. O método mais tarde, no entanto, não permite que as células individuais a serem rastreados por longos períodos de tempo, devido à elevada densidade de células marcadas. Foi utilizado um microscópio de campo amplo fluorescente vertical equipado com uma câmara CCD para obter um intervalo de aquisição relativamente rápida (uma image cada 15 segundos, ou 30) para identificar com segurança as fases estacionária e migratórias. A identificação precisa da duração das fases estacionárias e migratório é crucial para a interpretação inequívoca dos resultados. Também realizamos várias z-passo aquisições para monitorar a migração neuroblastos em 3D. De campo amplo imagem fluorescente tem sido amplamente utilizado para a visualização de migração neuronal 7-10. Aqui, nós descrevemos protocolo detalhado para a marcação de neuroblastos, executando em tempo real de imagens de vídeo de migração dos neuroblastos em fatias agudas do cérebro anterior do rato adulto, e analisando a migração celular. Embora o protocolo descrito exemplificado a migração dos neuroblastos da RMS adulto, ele também pode ser usado para seguir a migração de células em cérebros embrionários e pós-natais cedo.
O direccionamento correcto de precursores neuronais para as regiões do cérebro adequadas é um processo fundamental subjacente a montagem correcta e função dos circuitos neurais. A grande maioria das células migram durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal no cérebro apenas em poucas regiões, tais como o giro, OB denteado e cerebelo, o deslocamento neuronal ainda ocorre. Os mecanismos de orquestrar a migração de células no cérebro pós-natal, contudo, permanece pouco compreendido. O conhecimento dos…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma Canadian Institutes of Health Research (CIHR) subvenção para ASJK foi parcialmente financiado por uma bolsa Université Laval. AS é o destinatário de uma Cátedra de Pesquisa do Canadá em neurogênese pós-natal.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |