We beschrijven een protocol voor real-time videoimaging van neuronale migratie in de muis voorhersenen. De migratie van viraal gemerkte of geënte neuronale precursors opgenomen in acute levende plakjes met breedveld fluorescerende beeldvorming met een relatief snelle verwerving interval de verschillende fasen van celmigratie, zoals de duur van de stationaire en migratiefasen en de snelheid van bestuderen migratie.
Er is een groot aantal cijfers blijkt dat aangeeft dat nieuwe functionele neuronen constitutief zijn gegenereerd op basis van een endogene pool van neurale stamcellen in beperkte gebieden van de volwassen hersenen van zoogdieren. Pasgeboren neuroblasten van de subventriculaire zone (SVZ) migreren langs de rostrale migratie stroom (RMS) naar hun eindbestemming in de bulbus olfactorius (OB) 1. In de RMS, neuroblasten tangentiaal migreren in ketens ensheathed door astrocytische processen met 2,3 bloedvaten als structurele steun en een bron van moleculaire factoren vereist voor migratie 4,5. In de OB, neuroblasten los van de ketens en migreren radiaal in de verschillende bulbaire lagen er te differentiëren in interneuronen en te integreren in het bestaande netwerk 1, 6.
In dit manuscript beschrijven we de procedure voor toezicht celmigratie in acute plakken van het knaagdier hersenen. Het gebruik van acute segmenten kan de assessment van celmigratie in de micro-omgeving die nauw lijken op in vivo omstandigheden en in hersengebieden die moeilijk toegankelijk zijn voor in vivo imaging. Bovendien voorkomt lange kweken voorwaarde bij organotypische en celkweken die uiteindelijk kunnen veranderen de migratie-eigenschappen van de cellen. Neuronale voorlopers in acute plakjes kan worden gevisualiseerd met behulp van DIC optiek of fluorescerende eiwitten. Virale labeling van neuronale precursors in de SVZ, neuroblasten enten van reporter muizen in de SVZ van wild-type muizen, en transgene muizen die fluorescent eiwit expressie in neuroblasten zijn geschikte werkwijzen voor het visualiseren neuroblasten en na de migratie. De latere methode echter geen afzonderlijke cellen worden bijgehouden voor lange tijd vanwege de hoge dichtheid van gemerkte cellen. We gebruikten een breed gebied fluorescent rechtop microscoop uitgerust met een CCD camera om een relatief snelle acquisitie interval (een ima verwezenlijkenge elke 15 of 30 sec) om betrouwbaar identificeren stationaire fasen en migratie. Een exacte beschrijving van de duur van de stationaire en trekkende fasen is cruciaal voor de eenduidige interpretatie van de resultaten. We hebben ook uitgevoerd meerdere z-stap overnames om neuroblasten migratie in 3D te volgen. Wide-field fluorescerende beeldvorming is uitgebreid gebruikt om neuronale migratie visualiseren 7-10. We beschrijven gedetailleerd protocol voor het labelen neuroblasten, uitvoeren real-time video-imaging van neuroblast migratie acute plakken van de volwassen muis voorhersenen en analyseren celmigratie. Hoewel de beschreven protocol voorbeeld de migratie van neuroblasten in de volwassen RMS kan ook worden gebruikt om celmigratie volgen embryonale en vroege postnatale hersenen.
De juiste targeting van neuronale precursors de juiste hersengebieden is een fundamenteel proces achter de juiste assemblage en functie van neurale circuits. De meeste cellen migreren tijdens de embryonale ontwikkeling en de postnatale hersenen slechts enkele regio's, zoals de OB, dentate gyrus en cerebellum, neuronale verplaatsing nog steeds plaats. De mechanismen orkestreren celmigratie in de postnatale hersenen blijven echter slecht begrepen. Kennis van de mechanismen en moleculaire pathways die betrokken zijn in…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) subsidie ASJK werd gedeeltelijk ondersteund door een Universite Laval gemeenschap. AS is de ontvanger van een Canada Research Chair in postnatale neurogenese.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |