Summary

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

Published: September 12, 2012
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

Abstract

יש גוף משמעותי של ראיות מצביעות על כך שתאי עצב חדשים נוצרים באופן פונקציונלי constitutively מברכת אנדוגני בתאי גזע עצביים באזורים מוגבלים של המוח של יונקי הבוגרים. neuroblasts יילוד מאזור subventricular (SVZ) נודד לאורך הנחל הנודד המקורי (RMS) ליעד הסופי שלהם בנורת חוש הריח (OB) 1. בRMS, neuroblasts להעביר באופן כלשהו ברשתות ensheathed ידי תהליכי astrocytic 2,3 באמצעות כלי דם כתמיכה מבנית ומקור לגורמים מולקולריים הנדרשים להגירת 4,5. בOB, neuroblasts להתנתק מהכבלים ולהעביר רדיאלית לשכבות השונות המוח המאורך שבו הם להתמיין לinterneurons ולהשתלב ברשת הקיימת 1, 6.

בכתב יד זה יתאר את ההליך לנדידת תאי ניטור בפרוסות חריפות של המוח המכרסם. השימוש בפרוסות חריפות מאפשר assessmאף אוזן גרון של נדידת תאים בmicroenvironment שדומה מאוד לתנאי vivo ובאזורים במוח שקשה לגשת לדימות vivo. בנוסף, זה ימנע מצב culturing ארוך כמו במקרה של תרבויות organotypic ותא שסופו של דבר עשוי לשנות את מאפייני הנדידה של התאים. מבשרי נוירונים בפרוסות חריפות ניתן דמיינו באמצעות אופטיקה DIC או חלבוני ניאון. תיוג הנגיפי של מבשרי נוירונים בSVZ, השתלת neuroblasts מעכברי כתב לתוך SVZ של עכברי סוג פראי, ושימוש בעכברים מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בneuroblasts כל השיטות המתאימות להמחשת neuroblasts ולאחר הגירתם. שיטה האחרת, לעומת זאת, אינה מאפשרת לתאים בודדים להיות במעקב במשך תקופות זמן ארוכים, בגלל הצפיפות הגבוהה של תאים שכותרתו. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ זקוף ניאון שדה רחב מצויד במצלמת CCD להשיג מרווח רכישה מהירה יחסית (1 image כל 15 או 30 שניות) באופן מהימן לזהות הנייח ושלבים נודדים. זיהוי מדויק של משך השלבים הנייחים ונדידה הוא חיוני לפרשנות חד המשמעית של תוצאות. גם בצענו רכישות מרובות z שלב כדי לפקח הגירת neuroblasts ב-3D. הדמית ניאון שדה רחב כבר בשימוש נרחב כדי להמחיש נדידה עצבית 7-10. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לתיוג neuroblasts, ביצוע וידאו בזמן אמת הדמיה של הגירת neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי העכבר המבוגר, וניתוח נדידת תאים. בעוד הפרוטוקול המתואר הודגם ההגירה של neuroblasts במבוגר RMS, זה יכול לשמש גם כדי לעקוב אחר נדידת תאים במוח לאחר לידה עוברי ומוקדם.

Protocol

1. תיוג מבשרי נוירונים Neuroblasts ניתן דמיין באמצעות עכברים מהונדסים כי סלקטיבי מבטאים חלבוני ניאון בneuroblasts (כלומר, DCX-GFP, Gad67-GFP), על ידי הזרקת חלקיקים נגיפיים מקודדים חלבוני ניאון לSVZ או RMS stereotaxically, או על ידי השתלת מבשרי נוירונים ?…

Discussion

המיקוד הנכון של מבשרי נוירונים לאזורי המוח המתאימים הוא תהליך יסוד של ההרכבה והתפקוד התקין של מעגלים עצביים. הרוב המכריע של תאים נודדים במהלך התפתחות עוברית ובמוח לאחר הלידה רק בכמה אזורים, כגון gyrus OB, המשונן ומוח הקטן, התזוזה עצבית עדיין מתרחשת. המנגנונים מנצחים נדי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכון קנדי ​​לבריאות מחקר (CIHR) המענק לASJK מומן בהחלק על ידי מלגת אוול אוניברסיטה. AS הוא הנמען של קנדה מחקר קתדרת neurogenesis לאחר הלידה.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Sucrose Sigma S9378
Glucose (ACSF) EMD DX0145-3
NaCI Sigma S9625
KCI Sigma P9541
MgCI2x6H2O Sigma-Aldrich M2670
NaHCO3 Sigma S5761
NaH2PO4xH2O EMD SX0710-1
CaCI2x2H2O Sigma-Aldrich C3881
Dextran TexasRed Invitrogen D1864
Dextran CascadeBlue Invitrogen D1976
Glucose (40X solution) Sigma G8769
Sodium pyruvat Gibco 11360-070
HEPES Sigma H3375
HBSS Gibco 14170-112
DNase I Sigma D-5025
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Neurobasal medium Gibco 21103-049
BSA EMD 2930
Pen/Strep Life Technologies 15140-122
Ketamine/Xylazine CDMV 5230
Pasteur pipette VWR 14672-380
15 ml conical tube Sarstedt 62.553.205
50 ml conical tube Sarstedt 62.547.205
Glass capillaries (stereotaxic injection) WPI 4878
Paraffin oil EMD PX0045-3
Proviodine Rougier 65655-1370
Suture Stoelting 50487
Anafen CDMV 11508
20 cc Syringe VWR SS-20L2
Petri dish VWR 25384-094
Agar Laboratoire Mat AP-0108
Glue Permabond 910
95% O2/5% CO2 Linde 24068835
Blade WPI 501901
Nylon mesh Warner Instruments 64-0198
Centrifuge Eppendorf 5702 000.019
Pipette puller Sutter Instrument P-97
Nanoliter injector WPI B203MC4
Stereotaxic injection apparatus WPI 502900
Micro drill system WPI 501819
Vibratome Thermo Scientific 920110
Wide-field fluorescent microscope Olympus BX61WIF
CCD camera Photometrics CS-HQ2-D
Ultra-quiet imaging chamber Harvard Apparatus 64-1487
PH-1 Series 20 heater platform Harvard Apparatus 64-0284
Heating system Warner Instruments TC-344B
40X water immersion objective Olympus 1-UM587
10X water immersion objective Olympus 1-UM583
Lambda DG-4 Sutter Instruments DG-4/OF
MetaMorph software Molecular Devices 40000
Imaris software Bitplane BPI-IM70-F1

References

  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
  3. Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
  4. Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
  5. Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
  6. Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
  7. Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
  8. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
  9. Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
  10. Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
  11. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
  12. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
  13. Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
  14. Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
  15. Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  16. Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
  17. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
  18. Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).

Play Video

Cite This Article
Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain. J. Vis. Exp. (67), e4061, doi:10.3791/4061 (2012).

View Video