Vi beskriver ett protokoll för realtid videoimaging av neuronala migration i mus framhjärnan. Migrationen av viralt märkta eller ympas neuronala prekursorer noterades i akuta levande skivor med brett fält fluorescerande avbildning med en relativt snabb förvärv intervall för att studera de olika faserna av cellmigration, inklusive varaktigheten för den stationära och faser migration och hastighet migration.
Det finns en avsevärd mängd bevis för att nya funktionella nervceller konstitutivt genereras från en endogen pool av neurala stamceller i begränsade områden av den vuxna däggdjur hjärnan. Nyfödda neuroblaster från subventrikulära zonen (SVZ) vandrar längs rostrala vandrande ström (RMS) till slutdestinationen i luktbulben (OB) 1. I RMS, neuroblaster vandrar tangentiellt i kedjor ensheathed av astrocytiska processer 2,3 med blodkärl som strukturellt stöd och en källa av molekylära faktorer som krävs för migration 4,5. I OB, neuroblaster lossna från kedjorna och migrera radiellt in i de olika bulbära lagren där de differentierar till interneuronen och integreras i det befintliga nätet 1, 6.
I detta manuskript beskriver vi proceduren för övervakning cellmigration vid akuta skivor av gnagare hjärnan. Användningen av akut skivor låter assessment av cellmigration i mikromiljön som nära liknar till in vivo förhållanden och i hjärnan regioner som är svåra att komma åt för in vivo imaging. Dessutom undviker man långa odling skick som i fallet med organotypiska och cellkulturer som så småningom kan ändra migration egenskaper cellerna. Neuronala prekursorer i akuta skivor kan visualiseras med användning av DIC optik eller fluorescerande proteiner. Viral märkning av neuronala prekursorer i SVZ, ympning neuroblaster från reporter möss i SVZ av vildtypsmöss, och användning av transgena möss som uttrycker fluorescerande protein i neuroblaster är alla lämpliga metoder för att visualisera neuroblaster och efter deras migrering. Den senare metoden, emellertid, inte tillåter individuella celler som skall spåras under långa tidsperioder på grund av den höga densiteten av märkta celler. Vi använde ett brett fält fluorescerande upprätt mikroskop utrustat med en CCD-kamera för att uppnå en relativt snabb förvärv intervall (ett imaGE var 15 eller 30 sekunder) att tillförlitligt identifiera stationära och migrerande faser. En exakt identifiering av den tid de stationära och vandrande faser är avgörande för entydig tolkning av resultaten. Vi utförde också flera z-steg förvärv för att övervaka neuroblaster migration i 3D. Wide-området fluorescerande avbildning har använts i stor utsträckning för att visualisera neuronala migration 7-10. Här beskriver vi detaljerat protokoll för märkning neuroblaster, utför realtidsvideo-avbildning av neuroblast migration i akuta skivor av den vuxna musen framhjärnan och analysera cellmigration. Medan den beskrivna protokoll exemplifieras migration av neuroblaster i vuxna RMS, kan den också användas för att följa cellmigration i embryonala och tidiga postnatala hjärnor.
Den korrekta målinriktning av neuronala prekursorer till lämpliga hjärnregioner är en fundamental process som ligger till grund för korrekt montering och funktion av neurala kretsar. De allra flesta celler migrerar under embryonal utveckling och den postnatala hjärnan endast i ett fåtal regioner, till exempel OB, dentate gyrus och cerebellum, neuronal förskjutning sker fortfarande. De mekanismer iscensätta cellmigration i den postnatala hjärnan kvarstår dock dåligt kända. Kunskap om mekanismer och molekylä…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en kanadensisk Institutes of Health Research (CIHR) bidrag till ASJK delvis stöds av en Université Laval gemenskap. AS är mottagaren av ett Kanada forskning ordförande i postnatal neurogenes.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |