הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).
טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.
כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N 1 שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n 2 <1 n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ ג = arcsin (n 2 / n 1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = 0 אני ez / ד (Θ). אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי
ד (Θ) = (λ/4π) (1 2 חטא n 2 Θ – n 2 2) -1 / 2
כפי שדווח בספרות 1,2, אני 0 </sUB> מתאים לעוצמת אור תקרית שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n 2 / n 1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי
T (Θ) = 4 cos 2 Θ / [1 – (n 2 / NL 1) 2]
לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר 3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי
אני F (Θ) = AT (Θ) OC (z) דואר z / ד (Θ) dz
אם כל הגורמים שהם f עצמאי rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע
– או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך
אני F = ג T (Θ) ד (Θ) דואר Δ / ד (Θ)
– או בין z = Δ – t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ
אני F = ג T (Θ) טה-Δ / ד (Θ),
אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ.
כפי שדווח בעבר 3, תמונת רכישה וההערכה דורשת
– הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם,
– תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n 1 ו n 2 למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע.
בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.
שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית 7 או במולקולה בודדה 8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה 11 הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו,…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים הארץ באדן וירטמברג וEuropäische האיחוד יורופאישר Fonds für die Regionale Entwicklung – למימון ZAFH פוטון n, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) למימון מחקר מענק לא. 1792C08 כמו גם באדן וירטמברג-Stiftung GmbH למימון הפרויקט "Aurami".
Name | Company | Type | Comments |
Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |