Uitgebreide Profilering van Dopamine verordening in de substantia nigra en het ventrale tegmentale gebied

Summary

Dopamine is duidelijk geregeld in de middenhersenen kernen, die de cellichamen en dendrieten van de dopamine neuronen bevatten. Hier beschrijven we een dissectie en sample-handling aanpak om de resultaten te maximaliseren, en dus conclusies en inzichten, op dopamine regelgeving in de middenhersenen kernen van de substantia nigra (SN) en ventrale tegmentale gebied (VTA) bij knaagdieren.

Abstract

Dopamine een krachtig onderzocht neurotransmitter in het CNS. Inderdaad, heeft zijn betrokkenheid bij de bewegingsactiviteit en beloning gerelateerd gedrag bevorderd vijf decennia van onderzoek naar de moleculaire tekortkomingen in verband met dopamine regelgeving. Het merendeel van deze onderzoeken van dopamine regelgeving in de hersenen focus op de moleculaire basis voor de regulering in de terminal gebied regio's van de nigrostriatale en mesoaccumbens paden, striatum en de nucleus accumbens. Bovendien hebben deze studies gericht op de analyse van dopamine weefsel inhoud met normalisatie alleen nat weefsel gewicht. Onderzoek van de eiwitten die regelen dopamine, zoals tyrosine hydroxylase (TH) eiwit, TH fosforylering, dopamine transporter (DAT), en vesiculaire monoamine transporter 2 (VMAT2) eiwit vaak niet een analyse omvatten van dopamine weefsel inhoud in hetzelfde monster. De mogelijkheid om zowel dopamine weefsel inhoud en het regelen van eiwitten (waaronder post-tra te analyserennslational wijzigingen) geeft niet alleen inherente kracht om het interpreteren van de relatie van dopamine met het eiwit-niveau en de functie van TH, DAT, of VMAT2, maar strekt zich ook uit monster economie. Dit vertaalt zich in lagere kosten, en toch levert inzichten in de moleculaire regulatie van dopamine in vrijwel elke paradigma van de onderzoekers 'keuze.

We richten ons de analyses in de middenhersenen. Hoewel de SN en VTA worden meestal genegeerd in de meeste studies van dopamine regelgeving, worden deze kernen gemakkelijk ontleed met de praktijk. Een uitgebreide uitlezing van dopamine weefsel inhoud en TH, DAT, of VMAT2 kunnen worden uitgevoerd. Er is snel groeiende literatuur over de invloed van dopamine functie in de SN en VTA op het gedrag en de impingements van exogene stoffen of ziekte processen die in ^1-5. Bovendien, verbindingen zoals groeifactoren hebben een diepgaand effect op dopamine en dopamine-regulerende eiwitten, met een relatief grotere mate in de SN of VTA <sup> 6-8. Daarom wordt deze methode gepresenteerd voor verwijzing naar de laboratoria die willen op hun vragen uit te breiden over de manier waarop specifieke behandelingen moduleren gedrag en dopamine regelgeving. Hier wordt een multi-step methode gepresenteerd voor de analyses van dopamine weefsel inhoud, het eiwit niveau van TH, DAT, of VMAT2, en TH fosforylering van de substantia nigra en de VTA van knaagdieren middenhersenen. De analyse van TH fosforylatie kan tot significante inzichten niet alleen hoe TH activiteit wordt gereguleerd, maar ook signaleringscascades getroffen in somatodendritisch kernen in een bepaalde paradigma.

Wij illustreren de ontleding techniek om deze twee kernen en het monster verwerking van ontleed weefsel dat een profiel waaruit moleculaire mechanismen van dopamine regeling in vivo, specifiek voor elk kernen (figuur 1) levert scheiden.

Protocol

1. Ontleding Op een bedje van nat-ijs, chillen een knaagdier hersenen matrix (coronale secties gescheiden 1 mm van elkaar), een petrischaal met 5 scheermesjes, en een # 11 scalpel. In een aparte container, plaats 2 ml grootte microfugebuisje buizen label in droog ijs. De onderzoeker zal kiezen voor de methode van euthanasie. Wij hebben reproduceerbare resultaten uitvoeren van een zeer korte verdoving met isofluraan, ideale een verdamper worden gebruikt. Echter, indien niet beschikbaar, gebruiken we …

Discussion

Zoals in figuur 1, dienen de hierboven beschreven leveren meerdere metingen van dopamine en regulerende eiwitten TH, DAT en VMAT2 van een monster van SN of VTA verkregen van ofwel de rat of muis. Nogmaals, de voordelen van het uitvoeren van dit protocol is dat de onderzoeker kan operationeel op elkaar afgestemde uitlezingen van de manier waarop dopamine is geregeld in vivo onder nagenoeg alle experimentele paradigma, en daarmee belangrijke experimentele middelen te besparen door het verminderen van het aantal d…

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.