La dopamine est nettement réglementée dans les noyaux du mésencéphale, qui contiennent les corps cellulaires et les dendrites des neurones dopaminergiques. Nous décrivons ici une approche de dissection et manipulation d'échantillons de maximiser les résultats, et donc les conclusions et les points de vue, sur la réglementation de la dopamine dans les noyaux du mésencéphale de la substantia nigra (SN) et l'aire tegmentale ventrale (VTA) chez les rongeurs.
La dopamine est un neurotransmetteur vigoureusement étudiée dans le SNC. En effet, son implication dans l'activité locomotrice et la récompense liée au comportement a favorisé cinq décennies d'enquête sur les carences moléculaires associés à la réglementation la dopamine. La majorité de ces demandes de régulation de la dopamine dans le cerveau sur mise au point de la base moléculaire de sa réglementation dans les régions de champ terminales des voies nigrostriataux et mesoaccumbens; striatum et le noyau accumbens. En outre, ces études se sont concentrées sur l'analyse du contenu des tissus de la dopamine avec la normalisation du poids des tissus seulement humide. Enquête sur les protéines qui régulent la dopamine, comme la tyrosine hydroxylase (TH) des protéines, la phosphorylation TH, transporteur de la dopamine (DAT), et vésiculaires transporteur de monoamines 2 (VMAT2) protéine souvent ne comprennent pas l'analyse du contenu des tissus de la dopamine dans le même échantillon. La capacité à analyser à la fois le contenu des tissus de la dopamine et de ses protéines régulatrices (y compris post-tramodifications nslational) ne donne pas seulement le pouvoir inhérent à l'interprétation de la relation de la dopamine au niveau des protéines et la fonction de TH, DAT ou VMAT2, mais s'étend également l'économie de l'échantillon. Cela se traduit par un coût moindre, tout en produisant un aperçu de la régulation moléculaire de la dopamine dans pratiquement n'importe quel paradigme de choix des enquêteurs.
Nous nous concentrons les analyses dans le mésencéphale. Bien que le SN et VTA sont généralement négligé dans la plupart des études de régulation de la dopamine, ces noyaux sont facilement disséqué avec la pratique. Une lecture complète du contenu du tissu de la dopamine et TH, DAT ou VMAT2 peut être effectuée. Il est en plein essor la littérature sur l'impact de la fonction de dopamine dans le SN et VTA sur le comportement, et les empiétements de substances exogènes ou des procédés qui y sont la maladie 1-5. En outre, des composés tels que les facteurs de croissance ont un effet profond sur les protéines de la dopamine et la dopamine-régulation, dans une mesure relativement plus grande dans le SN ou VTA <sup> 6-8. Par conséquent, cette méthode est présentée à titre de référence aux laboratoires qui veulent étendre leurs enquêtes sur la façon dont les traitements spécifiques moduler le comportement et régulation de la dopamine. Ici, une méthode multi-étape est présentée pour les analyses de la teneur des tissus dopamine, les teneurs en protéines de TH, DAT ou VMAT2 et la phosphorylation de la TH substantia nigra et VTA de mésencéphale rongeurs. L'analyse de la phosphorylation de TH peut donner des informations importantes sur la façon dont non seulement l'activité TH est réglementée, mais aussi les cascades de signalisation affectées dans les noyaux somato dans un paradigme donné.
Nous allons illustrer la technique de dissection de séparer ces deux noyaux et le traitement d'échantillons de tissus disséqués qui produit un profil révélant les mécanismes moléculaires de régulation de la dopamine in vivo, spécifiques pour chaque noyaux (figure 1).
Comme il est indiqué dans la figure 1, les méthodes décrites ci-dessus devrait produire plusieurs lectures de la dopamine et son TH régulation des protéines, DAT, et VMAT2 d'un échantillon de SN ou VTA obtenu à partir de chez le rat ou la souris. Encore une fois, les avantages de la réalisation de ce protocole sont que l'enquêteur peut obtenir un indicateur de vue opérationnel appariés de la façon dont la dopamine est régulée in vivo dans pratiquement n'importe quel paradigme …
The authors have nothing to disclose.
Financement pour le travail cela, et comme cité 2,10, a été fourni, en partie, par un octroi de subventions de recherche à MF Salvatore de la Fédération américaine de recherche sur le vieillissement, Edward P. Le Fonds d'affectation spéciale et Stiles Biomedical Research Foundation du Nord-Ouest en Louisiane, et à la norme BS Pruett de la Bourse Muslow Ike prédoctoral, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | – J.T. Baker | 4095-02 |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG |
Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG |
Glycerol | Sigma | G8773-500 mL |
PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG |
dPBS | Gibco | 21600-069 |
Tween20 | Sigma | P1379-500 mL |
Glycine | Sigma | G8898-1KG |
Ponceau S | Fluka | 81460 |
Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G |
Dithiothreitol | Sigma | D-9163 |
Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL |
Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo- Fisher Scientific | 23223 |
Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 |
[125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer |
Table 2. Specific reagents.
Reagents | Formulas |
10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 |
1% SDS (pH to 8.2) |
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Copper II Sulfate Solution |
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3X Sample Buffer |
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1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 |
10X Running Buffer (Makes 4 L) |
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10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) |
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Ponceau |
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.2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 |
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) |
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10X Blot Buffer (Makes 4 L) |
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Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.